[发明专利]一种体外评价卡介苗对中性粒细胞活性影响的方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的体外评价卡介苗对中性粒细胞活性影响的方法，其特征在于，至少包括如下步骤：

提供培养板；

在所述培养板上接种靶细胞；

制备卡介苗悬液；

将中性粒细胞和所述卡介苗悬液共同作用于所述靶细胞；

向所述培养板中添加细胞增殖检测试剂；

检测所述培养板中吸光度的变化；

根据所述吸光度的变化计算靶细胞的存活率，靶细胞存活率计算的具体过程为：接种靶细胞、中性粒细胞、有或无卡介苗的实验孔的吸光度以字母A表示；只接种靶细胞的实验孔的吸光度以字母B表示；只接种中性粒细胞、有或无卡介苗的实验孔的吸光度以字母C表示；不接种任何细胞的空白孔的吸光度以字母D表示，则靶细胞的存活率＝(A-C)/(B-D)×100％；

获得所述中性粒细胞的步骤包括：

配制若干组浓度梯度的淋巴细胞分离液；

将所述若干组浓度梯度淋巴细胞分离液按照浓度从大到小的顺序加入到离心管中，使浓度最小的淋巴细胞分离液位于所述离心管的最上层；

采集1-2ml外周血并稀释1-3倍，获得稀释后的外周血；

取1-4ml所述稀释后的外周血加入到所述浓度最小的淋巴细胞分离液上；

利用所述若干组浓度梯度的淋巴细胞分离液，通过分离提取步骤获得所述中性粒细胞；

所述卡介苗悬液中的卡介苗、所述中性粒细胞和所述靶细胞之间的作用比例为(500-2000)：(3-20)：1；

所述靶细胞为人宫颈癌细胞Hela、人膀胱癌细胞5637或人膀胱癌细胞J82。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备卡介苗悬液的步骤包括：

将卡介苗接种于液体培养基中进行培养；

测量所述液体培养基中的OD600值；

待所述OD600值达到2.0-2.1值或以上时，收集所述液体培养基中的卡介苗并进行离心处理，获得上清液和沉淀层；

吸弃所述上清液，通过细胞培养基重悬所述沉淀层，获得所述卡介苗悬液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在将所述卡介苗接种于所述液体培养基中后，培养条件为在35-37℃培养5-14天。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基与接种所述靶细胞的培养基为同一类型的培养基，接种所述靶细胞的培养基位于所述培养板内。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞分离液的组数为5-8组。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养板为96孔细胞培养板。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述培养板上接种靶细胞的步骤中，所述靶细胞的密度为8000-12000细胞/孔。