[发明专利]一种用于检测基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法在审
| 申请号： | 201911002140.1 | 申请日： | 2017-04-21 |
| 公开（公告）号： | CN110734969A | 公开（公告）日： | 2020-01-31 |
| 发明（设计）人： | 徐瑶;宋如晦;石伟林;代洋;许娜;廖兴华;张同存 | 申请（专利权）人： | 武汉科技大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6883 | 分类号： | C12Q1/6883;C12Q1/683 |
| 代理公司： | 42242 武汉蓝宝石专利代理事务所(特殊普通合伙) | 代理人： | 王振宇 |
| 地址： | 430000 *** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 单核苷酸多态性 琼脂糖凝胶电泳 基因启动子区 限制性内切酶 基因多态性 转录起始点 基因组DNA 待测样本 多态位点 基因序列 酶切产物 引物对P 一分为二 检测 缓冲 测序 分型 引物 消化 基因 | ||
1.一种用于检测基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于：以糖尿病患者和正常人的血液基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶、缓冲环境、Mg++、dNTPs存在的情况下，利用聚合酶链式反应引物对P进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定待测样本的单核苷酸多态性。
2.如权利要求1所述用于检测基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述的聚合酶链式反应引物对P为：
上游引物P-F：5’-CCTGGAGTACCAGGAAGGACAGC-3’23nt
下游引物P-R：5’-TTACACGTATGAGCCACC-3’18nt
引物P-F中带有下划线的碱基为错配碱基，目的是引入Hha I的酶切位点；
PCR扩增后，将产物一分为二，一部分PCR产物用限制性内切酶HhaI进行消化，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定CREB1基因第-1354位的碱基多态性；另一部分PCR产物用限制性内切酶Xsp I进行消化，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定CREB1基因第-1343位的碱基多态性。
3.一种权利要求1所述用于检测基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述的PCR扩增条件是：20μL反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，2×Buffer 10μL(内含Mg++、dNTPs等)，0.45μL基因组DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL和灭菌超纯水8.3μL；
所述的PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸35s，35个循环；72℃延伸10min。
4.根据权利要求1所述的用于检测基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的浓度都为3.0％。
5.根据权利要求1所述的用于检测基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，检测到的人CREB1基因启动子区多态性为：基因组第-1354位T>G突变；基因组第-1343位T>A突变。
6.根据权利要求1所述的用于检测基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，通过电泳判定CREB1基因第-1354位的碱基多态性为：TT基因型表现为161bp条带；TG基因型表现为161、139和22bp条带；GG基因型表现为139和22bp条带。
7.根据权利要求1所述的用于检测基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，通过电泳判定CREB1基因第-1343位的碱基多态性为：AA基因型表现为161bp条带；AT基因型表现为161、125和36bp条带；TT基因型表现为125和36bp条带。
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