[发明专利]一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR现场快速检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂盒，属于兽用生物诊断制品的生产和技术领域，所述试剂盒包括：缓冲液B1、缓冲液B2、PCR反应液、阳性对照和阴性对照；缓冲液B1快速裂解样品，释放病毒核酸；缓冲液B2：用于稳定提取的病毒核酸，消除对PCR反应的抑制作用；PCR反应液：由2×Premix Ex Taq^TM酶混合液和ASFV特异性的上下游引物以及荧光探针组成，其中酶混合液中添加有Tli RnaseH。本发明使用易于裂解的两种缓冲体系直接对样品中的核酸DNA进行裂解，不仅大大减少了样品提取核酸DNA的时间和操作步骤，节省了检测时间，且适于运输和保存。

技术领域

本发明属于兽用生物诊断制品的生产和技术领域，涉及一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒的研制及用途，具体涉及一种快速检测猪和猪肉制品中非洲猪瘟病毒核酸的快速检测试剂盒的研制和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African SwineFever Virus,ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，发病迅速，病死率高达90％以上，严重危及到养猪业的发展。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告疫病，被我国列为一类传染病。2018年8月3日，我国首次ASF暴发于沈阳市某猪场，自此以后我国20多个省份又陆续暴发100多起非洲猪瘟疫情，给我国养猪业带来了巨大损失。ASFV基因组庞大，可达160-190kb，产生的结构蛋白超过了50种，且ASFV感染宿主后诱导宿主产生的中和抗体水平很低甚至不产生中和抗体，这些特性加大了非洲猪瘟的防治难度。尽管非洲猪瘟病毒的主要宿主为家猪和野猪以及软蜱，但其存活能力强、传播途径多样，在粪便、血清、鲜肉和肉制品中均可长期存活，并通过泔水、车辆和人员机械携带、排泄物和分泌物等不断传播，因此，一个地区一旦发生ASFV后就很难消除。

目前针对ASF防控尚无有效的商品化疫苗，因此疫情防控的监测与诊断变得至关重要。实验室检测ASFV方法有血清学方法和病原学方法，血清学方法主要有间接酶联免疫吸附实验、阻断酶联免疫吸附实验和间接荧光抗体试验；病原学检测方法有直接免疫荧光法、双抗体夹心ELISA法、普通PCR法和荧光PCR法。双抗体夹心酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应等方法是检测ASFV的病原学检测方法。但由于ASFV单克隆抗体的质量和性能不高，双抗体夹心酶联免疫吸附试验基本很少使用，目前主要使用聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)进行非洲猪瘟病原检测。另外由于普通聚合酶链式反应的敏感性比实时荧光聚合酶链式反应低100倍左右，因此，qPCR成为目前最常用的检测ASFV的方法。

目前，荧光定量PCR检测试剂盒是比较常用的现场快速检测方法，其中病毒核酸提取方法包括柱式提取法或磁珠法，这些方法提取的病毒核酸纯度较高，但同时也有很多不足之处：1)病毒核酸的提取过程步骤多，时间久；2)提取所用到的仪器种类多，不适宜于大型企业或养殖业的现场快速检测；3)提取所用到的试剂种类多，取用不便，容易出错；4)提取中使用乙醇等试剂，运输和使用都存在安全隐患；5)提取对操作人员的要求很高，需要对基层人员开展大量培训；6)提取方法的敏感性过高，容易导致检测结果差异性太大。

与此同时，面对非洲猪瘟的紧迫压力，作为防控非洲猪瘟关键环节的屠宰场和养殖场对非洲猪瘟的检测要求不断提高，既要保证检测方法具有较高的敏感性，同时又要快速、简便、可操作性强，对人员、仪器、场地设施和操作水平要求低，因此，本发明针对上述要求，研制了一种能够快速准确检测ASFV的荧光定量PCR快速检测试剂盒，并在实际检测工作中经过了大量用户的检验和认可。

发明内容