[发明专利]一种基于细菌內源同源重组系统的基因组编辑方法

权利要求书

1.一种基于细菌內源同源重组系统的基因组编辑方法，其特征是将负载了基因组编辑系统的质粒转化至宿主细胞之后先不启动基因组编辑系统，而是通过细胞繁殖增加细胞的数量和活性，细胞繁殖一段时间之后再启动基因组编辑系统，通过CRISPR/Cas9系统对DNA的切割和內源同源重组系统对DNA的修复实现对细菌基因组的高效编辑。

2.如权利要求1所述一种基于细菌內源同源重组系统的基因组编辑方法，其特征在于采用如下步骤：

A.构建一个以质粒为载体的基因组编辑系统,该系统由Cas9编码基因、sgRNA编码基因和DNA修复模板组成，Cas9编码基因和sgRNA编码基因由诱导型启动子控制。

B.将负载了基因组编辑系统的质粒转化至待编辑的宿主菌株中，得到的转化子在液体培养基中培养使细胞增殖。

C.待细胞增殖至指数期，加入诱导剂诱导Cas9蛋白和sgRNA表达。

D.诱导2–3小时后，将菌液以不同的稀释度涂在含有诱导剂的平板上。

E.从步骤D中的平板上挑取单菌落做PCR验证，获得正确的编辑菌株。

3.如权利要求2所述的一种基于细菌內源同源重组系统的基因组编辑方法，其特征在于步骤A中，所述的质粒载体为单质粒载体或双质粒载体，所述的诱导型启动子包括但不限于P_BAD等所有严谨性强的诱导型启动子。

4.如权利要求2所述的一种基于细菌內源同源重组系统的基因组编辑方法，其特征在于步骤A中，构建基因组编辑系统时，只利用Cas9编码基因和sgRNA编码基因，而没有利用任何λ-Red等外源修复蛋白的编码基因，所利用的Cas9包括SpCas9和所有SpCas9的突变体。

5.如权利要求2所述的一种基于细菌內源同源重组系统的基因组编辑方法，其特征在于步骤B中，所述的宿主菌株包括但不限于大肠杆菌等所有可以采用CRISPR/Cas9技术的细菌菌株。

6.如权利要求2所述的一种基于细菌內源同源重组系统的基因组编辑方法，其特征在于步骤C中，诱导剂诱导发生在细胞增殖至指数期时。