[发明专利]一种基于COI基因序列的*和贝氏*的分子鉴别方法

说明书

本发明公开了一种基于COI基因序列的和贝氏的分子鉴别方法。该方法包含以下步骤：(1)分别提取和贝氏基因组DNA；(2)PCR扩增与贝氏的细胞色素氧化酶亚基I基因,(3)扩增产物纯化后，直接测序，的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.3所示,贝氏的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.4所示；COI基因第18位点碱基是T的为贝氏，若该位点是C的为。该方法可以快速、简便、准确、有效地鉴别与贝氏，结果稳定性好，重复率高，填补了目前国内分子生物学标准鉴别与贝氏的空白，也有利于开展与贝氏物种多样性和遗传多样性研究。

技术领域

本发明属于遗传学领域，涉及一种基于COI基因序列的和贝氏的分子鉴别方法。

背景技术

(Hemiculter leucisculus)和贝氏(Hemiculter bleekeri)隶属于鲤形目鲌亚科属，是一类繁殖快、生活力强的小型鱼类，可食用，具有一定的经济价值。和贝氏在我国分布极广，从南至北诸河流及湖泊均有，静水、流水中都能生长、繁殖，数量较多，是鱼类生态系统的重要组成部分，具有重要的生态价值，也是群体遗传学研究的好材料。多年来，受过度捕捞、环境污染等不利因素的影响，和贝氏种群数量下降，遗传多样性水平降低。和贝氏生态位相近，形态和体色相似，在鱼类调查中很难区分和鉴别。目前用于鱼类物种鉴别的DNA序列有COI基因、Cytb基因、16S rRNA基因、微卫星等；但不同的物种适用的靶基因不同，即使靶基因相同，不同的靶区段依然会对结果产生显著影响，有的靶区段包含特异性位点能够用于物种鉴别，有的靶区段并不包含特异性位点，不能用于物种鉴别。

发明内容

本发明的目的是针对形态区分的困难，提供一种和贝氏的分子遗传鉴别方法。

本发明的另一目的是提供一种用于和贝氏的分子遗传鉴别的引物对。

本发明的又一目的是提供该引物对的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种和贝氏的分子遗传鉴别方法，包含以下步骤：

(1)分别提取待鉴定的和贝氏基因组DNA；

(2)以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增与贝氏的细胞色素氧化酶亚基I基因,所述的上游引物为F：SEQ ID NO.1，下游引物为R：SEQ ID NO.2；

(3)扩增产物纯化后，直接测序，的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.3所示,贝氏的COI基因扩增产物如SEQ ID NO.4所示；COI基因第18位点碱基是T的为贝氏若该位点是C的为

作为本发明方法的优选，所述的PCR反应体系为50μL：80ng/μL的模板DNA 1μL，PCR缓冲液5μL，dNTP混合液4μL，每种dNTP 0.1mmol/L，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2μL2.5IU的Taq酶；双蒸水36μL；所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/LKCl，30mmol/L MgCl₂，0.01％(g/100ml)明胶组成；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸60s，经30个循环后再72℃延伸10min。

一种用于与贝氏的分子遗传鉴别的引物对，上游引物为F：SEQ ID NO.1，下游引物为R：SEQ ID NO.2。

本发明所述的引物对在分子遗传鉴别与贝氏中的应用。

本发明所述的引物对在制备与贝氏分子遗传鉴别试剂中的应用。

一种与贝氏分子遗传鉴别试剂，包含本发明所述的引物对。