[发明专利]一种基于人肝实质细胞用于功能性食品功效检测的方法

权利要求书

1.一种基于人肝实质细胞用于功能性食品功效检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1, 取功能性食品试样用超声波溶于超纯水，制成浓度为0.01 mg/mL的受试悬液；

S2，取六孔细胞培养板，按照细胞数（1-2）×10⁶每孔的密度接种肝实质细胞并设置样品组、阳性对照组和阴性对照组，样品组每孔加入200-300µL试样悬液，阳性对照组每孔加入200-300µL肝实质细胞培养基，阴性对照组每孔加入200-300µL纯水；

S3，样品组、阳性对照组和阴性对照组每孔再加入1-2mL肝实质细胞培养基，将细胞置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h；

S4，样品组、阳性对照组中每孔加入ConA溶液100-200µL，使终浓度为1μg/mL，阴性对照组加入等量的超纯水，细胞置于37℃、5% CO₂培养箱中培养2.5-4h；

S5，用细胞凋亡检测试剂盒检测肝实质细胞的凋亡情况，严格按照试剂盒说明书操作；

S6，用流式数据分析软件打开数据文件，区分出死细胞群、活细胞群和凋亡细胞群，并统计各自的百分比。

2.根据权利要求1所述的基于人肝实质细胞用于功能性食品功效检测的方法，其特征在于，人肝实质细胞的诱导分化步骤如下：

1）取人脐带间充质干细胞（8-10）×10⁶，用无血清间充质干细胞培养基培养，连续传三代后，取对数生长期的细胞用于试验；

2）加4.0-6.1μg/孔的0.1%明胶到六孔培养板中，缓慢摇匀液态明胶使其覆盖整个板底的底面；将铺有0.1%明胶的培养板底放置在超净台室温下20-40min；静置后，用微量移液器将明胶小心吸走弃去，培养板即包被完成可用于接种细胞；

3) 按照(8-10)×104个细胞/cm²的密度将之前培养的间充质干细胞接种在预包被明胶的六孔板中，每孔加入2-3mL无血清间充质干细胞培养基；将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养2天；

4）将8-13μL EGF和3-7μL bFGF全部加入到50mL成肝诱导分化基础培养基A中，配成预处理培养基，用摇床轻晃配置好的预处理培养基，室温混匀20min，振荡频率20次/min，混匀之后即可使用；小心吸掉六孔板中的培养基，每孔加入1.8-3.2mL预处理培养基,该培养基只能现配现用；将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养2天；

5）将2-3μL HGF和0.7-1μL bFGF加入到10mL成肝诱导分化基础培养基B中，确保混合均匀之后即为成肝诱导分化培养基；小心吸掉六孔板中的培养基，每孔加入2mL新鲜配置的成肝诱导分化培养基；将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养11-18天；根据培养体系颜色变化，每2-3天更换一次新鲜的成肝诱导培养基；

6）每3天将培养板置于倒置显微镜下观察细胞形态的变化；

7）11-18日培养后，视细胞分化生长情况进行对已分化的肝实质细胞的收获并可以冻存。

3.根据权利要求2所述的基于人肝实质细胞用于功能性食品功效检测的方法，其特征在于，步骤5）中根据颜色深浅对新鲜成肝诱导培养基进行更换时间的判断。

4.根据权利要求2所述的基于人肝实质细胞用于功能性食品功效检测的方法，其特征在于，步骤7）中选择梭形的上皮细胞样细胞少、不规则多角形的肝细胞样细胞多的肝实质细胞进行收获。