[发明专利]识别猪ROSA26基因的sgRNA及其编码DNA、基因编辑方法、试剂盒和应用

说明书

本发明提供了一种识别猪ROSA26基因的sgRNA及其编码DNA、基因编辑方法、试剂盒和应用，涉及基因工程技术领域。该特异性识别猪ROSA26基因的sgRNA识别猪ROSA26基因的第一内含子，且用于CRISPR/Cpf1系统，含有如SEQ ID NO.1所示的负责识别靶片段的序列。该sgRNA配合CRISPR/Cpf1系统，敲除效率为27％且特异性强，在进行序列敲除时，能有效减少脱靶现象，减少非特异性切割对基因组带来的不利影响。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种识别猪ROSA26基因的sgRNA及其编码DNA、基因编辑方法、试剂盒和应用。

背景技术

猪是我国重要的家畜品种之一，其在农业经济、医学疾病模型和分子遗传学研究中均有重要地位。而基因编辑猪在生物学研究、农业新品种培育以及生物医药研究中具有重要的应用价值，CRISPR/Cas9系统的出现极大的提高了猪的基因编辑效率，但目前还存在脱靶风险高以及外源基因定点整合效率较低的问题。

ROSA26基因是基因编辑中的一个安全位点，外源基因在安全位点可以稳定高效的表达，对细胞和组织无副作用，缺失ROSA26基因对细胞和组织也无影响。

因此改进对猪ROSA26基因进行基因编辑以及外源基因定点整合的方法，获取基因编辑或者外源基因定点整合的猪细胞或者个体，对猪的基因功能研究、新型基因编辑猪的制备和培育具有重要的应用价值。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种特异性识别猪ROSA26基因的sgRNA，该sgRNA用于CRISPR/Cpf1系统，能够特异性识别猪ROSA26基因的第一内含子。

本发明的第二目的在于提供一种含有编码上述sgRNA的序列的DNA分子。

本发明的第三目的在于提供一种上述特异性识别猪ROSA26基因的sgRNA或上述DNA分子的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种特异性识别猪ROSA26基因的sgRNA，所述sgRNA用于CRISPR/Cpf1系统；所述sgRNA含有如SEQ ID NO.1所示序列，所述SEQ ID NO.1所示序列负责识别靶片段。

优选地，所述sgRNA含有如SEQ ID NO.3所示序列。

优选地，所述猪ROSA26基因的第1内含子含有如SEQ ID NO.5所示序列。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了含有编码上述sgRNA的序列的DNA分子。

优选地，所述DNA分子含有如SEQ ID NO.2所示序列，所述SEQ ID NO.2编码所述sgRNA负责识别靶片段的部分。

优选地，所述DNA分子含有如SEQ ID NO.4所示序列，所述SEQ ID NO.4编码全长所述sgRNA。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种对猪基因组中ROSA26基因进行基因编辑的方法，该方法包括将(a)和(b)导入猪源生物材料中，以对猪基因组中ROSA26基因进行编辑；

(a)上述sgRNA或上述DNA分子；

(b)Cpf1分子，所述Cpf1分子包括Cpf1蛋白分子或Cpf1核酸分子。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种试剂盒，包含上述sgRNA、或上述DNA分子。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述sgRNA、上述DNA分子、上述方法或上述试剂盒在对猪进行基因编辑中的应用。