[发明专利]一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种采用试剂盒检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的方法包括大肠杆菌体内转录检测方法或大肠杆菌体外转录检测方法；

所述的试剂盒包括第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标；所述第一分子信标的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示，所述第二分子信标的核苷酸序列如序列表SEQID No:2所示，所述第三分子信标的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:3所示；

所述的大肠杆菌体内转录检测方法包括以下步骤：

(1)将大肠杆菌菌株接菌于LB培养基中进行培养，得到大肠杆菌菌液；

(2)将大肠杆菌菌液培养至对数生长期后，再往大肠杆菌菌液中添加利福平，继续进行培养；

(3)将上述培养的大肠杆菌菌液进行离心处理，得到沉淀的菌体；

(4)将菌体溶解于若干组LB培养基中进行培养，得到若干组新生菌液；

(5)每隔3-8min从其中一组新生菌液中离心分离出一组新生菌体，停止转录反应，并从新生菌体中提取出大肠杆菌的新生rRNA，得到若干组新生rRNA；

(6)依次将若干组新生rRNA分别与第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标进行混合后，再进行荧光检测，得到若干组新生rRNA的荧光强度值；

(7)根据若干组新生rRNA的荧光强度值，判断大肠杆菌rRNA转录速率的大小；

所述的大肠杆菌体外转录检测方法包括以下步骤：

S1、将大肠杆菌rRNA模板与反应液进行混合，得到混合液；然后，将混合液平均分成若干组进行转录反应，得到若干组反应物；

S2、每隔3-8min往其中一组反应物中添加沉淀剂，并将其置于低温条件下进行沉淀处理，停止转录反应，得到若干组转录产物；

S3、分别将若干组转录产物进行离心处理，得到若干组rRNA沉淀颗粒；

S4、依次将若干组rRNA沉淀颗粒分别与第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标进行混合后，再进行荧光检测，得到若干组rRNA的荧光强度值；

S5、根据若干组rRNA的荧光强度值，判断大肠杆菌rRNA转录速率的大小。

2.根据权利要求1所述的一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，大肠杆菌菌株与LB培养基的体积比为1:(90-110)。

3.根据权利要求1所述的一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，利福平在大肠杆菌菌液中的质量浓度为30-50μg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，离心处理的温度为2-6℃。

5.根据权利要求1所述的一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的步骤S1中，反应液包括Tris-HCl、KCl、MgCl₂、Triton X-100、ATP、GTP、CTP、UTP、RNase抑制剂和RNA聚合酶全酶；所述的步骤S2中，沉淀剂包括醋酸钠、乙醇和tRNA。

6.根据权利要求5所述的一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的步骤S1中，混合液中：大肠杆菌rRNA模板的质量浓度为1-2μg/mL，Tris-HCl的摩尔浓度为30-40μM，KCl的摩尔浓度为140-160μM，MgCl₂的摩尔浓度为8-12μM，Triton X-100的质量百分比浓度为0.01％-0.03％，ATP的质量浓度为0.4-0.6μg/mL，GTP的质量浓度为0.4-0.6μg/mL，CTP的质量浓度为0.4-0.6μg/mL，UTP的质量浓度为0.4-0.6μg/mL，RNase抑制剂的酶活力为30-50U/μL，RNA聚合酶全酶的酶活力为1-3U/μL。

7.根据权利要求5所述的一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的步骤S2中，沉淀处理的温度为-25℃～-15℃。