[发明专利]一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及应用

说明书

本发明公开了一种提高环介导等温（LAMP）扩增反应效率的方法及其应用，将富勒烯加入LAMP扩增反应体系当中进行等温扩增富勒烯，包括制备富勒烯试剂、LAMP扩增反应体系优化和LAMP扩增产物检测。本方法可有效提高LAMP扩增反应的灵敏度，并且能够抑制假阳性结果的出现、减少非特异性扩增，从而提高的检测效率。该方法可以被应用于食品安全检测领域，具有广泛应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及其应用。

背景技术

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是2000年发明的一种等温核酸体外扩增技术。该技术依赖于一种具有链置换特性的DNA聚合酶（如Bst酶），利用一对外引物（F3/B3）和一对内引物（FIP/BIP）与靶基因的6个不同区域退火杂交，使产物自我配对形成一种特殊的哑铃状结构，再通过内引物与哑铃状结构的互补配对，在等温条件下进行，扩增15min-1h即可产生10⁹～10¹⁰倍的扩增子。由于该技术灵敏度高，若实验环境被气溶胶污染，则很容易产生假阳性结果。另外，由于LAMP扩增反应过程中涉及到多条引物，引物间难免发生非特异性结合产生引物二聚体，会消耗反应体系中的反应底物，从而降低了反应的效率，降低检测灵敏度降低，同时又容易导致结果假阳性，使得结果误判。因此，如何建立一种既有更高检测灵敏度、又抑制非特异性扩增的LAMP扩增反应体系，一直是LAMP扩增技术领域急需解决的技术难题。

富勒烯是一种完全由碳组成的中空分子，形状呈球型、椭球型、柱型或管状。近年来，富勒烯被较多地应用于材料科学、电子学和纳米技术等领域。但尚未有将富勒烯应用于提高LAMP扩增反应效率的报道。

发明内容

针对现有LAMP扩增技术中所遇到的由于灵敏度高、实验环境易被气溶胶污染以及多条引物间发生非特异性结合而容易产生假阳性和灵敏度降低的问题，本发明目的在于提供了一种提高LAMP扩增反应效率的方法。通过向LAMP扩增反应体系中添加富勒烯材料来实现对LAMP扩增的优化，以提高灵敏度和特异性。

本发明的再一目的在于，提供所述方法的应用。

本发明目的通过下述方案实现：

一种提环介导等温扩增反应效率的方法，其特征在于，通过向环介导等温（LAMP）扩增反应体系中添加富勒烯材料来实现对LAMP扩增的优化，包括如下步骤：

（1）富勒烯制备：富勒烯试剂利用现有技术制备；

（2）LAMP扩增反应体系优化：将富勒烯加入LAMP扩增反应体系当中，然后进行LAMP扩增；

（3）LAMP扩增产物检测：可通过电泳检测、浊度检测或显色检测。

本发明提供了一种提高LAMP扩增反应效率的方法，能够进一步提高检测的灵敏度、抑制非特异性扩增，可以很好的解决在LAMP扩增检测方面遇到的技术难题。

本发明中，在25 µL的LAMP扩增反应体系中加入富勒烯的终浓度为0.25-40 μg/L。

本发明还提供一种在致病微生物检测中的应用。以及，

本发明也提供一种在检测肉品掺假中的应用。

本发明所述的应用中，LAMP扩增反应体系包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB，Bst DNA聚合酶，10×聚合酶缓冲液，dNTP，Mg²⁺，甜菜碱，富勒烯，双蒸水中的一种或多种。