[发明专利]利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法

说明书

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，包括以下步骤：第一步，培养种子液；第二步，将种子液依次发酵培养和诱导培养，第三步，诱导培养结束后，收菌，离心分离，洗涤，破菌，过滤，最后层析分离得到纯化的包被TP抗原。本发明在培养过程中对发酵培养基进行合理的补料调控，准确将发酵培养基的溶氧浓度控制在预设范围内，实现了菌株的高密度发酵培养，单批次菌体产能为传统工艺的4倍以上，大大提高了包被TP抗原的得率，其得率可高达11.23mg/g以上，包被TP抗原的纯度提高了18%；经验证本发明可重复性好，单批次产能高，降低了大规模生产包被TP抗原的成本。

技术领域

本发明涉及免疫学检测技术领域，尤其是涉及一种利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法。

背景技术

梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema Pallidum，即TP）引起的慢性传播疾病，其临床表现为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和潜伏梅毒等，人们感染梅毒后的头两年最具有传染性，如孕妇梅毒病期越早，对胎儿感染的机会就越大。因而，早期诊断对临床预防和治疗梅毒具有重大意义。

酶联免疫吸附试验（即ELISA）是酶免疫测定技术中应用最广的技术，具有灵敏度高和特异性高等优点而被广泛用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。ELISA包括双抗体夹心法和间接法，双抗体夹心法是临床上诊断梅毒的首选方法。对于双抗体夹心法检测梅毒来说，酶标记抗原质量的好坏是影响诊断结果的关键性因素，抗原的纯度越高，诊断结果就越可靠。

传统包被梅毒抗原的制备工艺是将TP表达的菌株直接接种到培养基中培养3～5天，TP表达耗时时间长，在培养过程中菌株死亡较多，单批次菌体产量很低，在制备包被TP抗原时需要多批次培养，不仅增加了成本，还延长了包被TP抗原获取周期，并且最终得到的包被TP抗原纯度较低，使得梅毒检测灵敏度较低，存在误诊。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，该方法通过补料控制发酵培养基的溶氧量及诱导时间，实现了重组大肠杆菌的高密度培养，降低菌株死亡率，将单批次菌体产能提高为传统工艺的4倍以上，大大提高了包被TP抗原的表达量和得率。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：

本发明所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，包括以下步骤：

第一步，挑取重组大肠杆菌菌株接种在LB培养基中培养15～16h，得一级种子；将得到的一级种子接种到LB培养基内扩大培养2～3h，得到二级种子液；

第二步，将第一步得到的二级种子液接种到发酵培养基中发酵培养，发酵培养2～3h后，取样检测发酵培养基中重组大肠杆菌菌株的OD600值，当OD600值为5～7时，降温，向发酵培养基内加入诱导剂诱导培养60～72h；

其中，在发酵培养阶段，发酵培养基的溶氧浓度≥40%；在诱导培养阶段，发酵培养基的溶氧浓度≥30%；

第三步，诱导培养结束后，收菌，离心分离，洗涤，重悬，破菌，过滤，最后层析分离得到纯化的包被TP抗原。

所述第一步中的重组大肠杆菌表达载体为pGEX4T-3，表达菌株为Arctic。

将所述第二步中发酵培养基的溶氧浓度控制在30%及其以上或40%及其以上的方法为：向发酵培养基内按照0.5mL/min的速度补加补料培养基，所述补料培养基的配方为：葡萄糖125g/L、酵母粉50g/L、蛋白胨50g/L、MgSO4·7H₂O 5g/L，补料培养基的pH为6.8～7.0。

所述第二步中的发酵培养温度控制在35～38℃，诱导培养温度控制在15～17℃。

所述第二步中的诱导剂IPTG，其浓度为0.4～0.6mmol/L。