[发明专利]基于细胞的鉴定IDO1酶活性及筛选IDO1酶抑制剂的荧光检测方法

说明书

本发明建立了一种在细胞层面鉴定吲哚胺2,3‑双加氧酶1活性及筛选吲哚胺2,3‑双加氧酶1酶抑制剂的荧光检测方法。本发明可供三种仪器检测IDO1酶酶活性：1、无需对样本进行任何形式的前期处理，直接取出培养基上清使用酶标仪检测，检测对象为色氨酸。2、将细胞用混合荧光体系孵育后荧光显微镜检测。3、将细胞用混合荧光体系孵育后流式细胞仪检测。本发明提供的方法不仅缩短了检测时间，还降低了操作复杂性，可在细胞水平检测IDO1酶活性并筛选IDO1酶抑制剂。

技术领域

本发明涉及荧光检测方法，尤其涉及本发明涉及基于细胞的鉴定IDO1酶活性及筛选IDO1酶抑制剂的荧光检测方法

背景技术

色氨酸是人体必需的一种氨基酸，参与多种蛋白的合成与代谢网络调节。在人体中，色氨酸的代谢主要通过犬尿氨酸途径进行代谢。

在犬尿氨酸代谢途径中，吲哚胺2,3-双加氧酶，即indoleamine 2,3-dioxygenase,缩写为IDO1，吲哚胺2,3-双加氧酶2，即indoleamine 2,3-dioxygenase，缩写为IDO2，色氨酸2,3-双加氧酶，tryptophan 2,3-dioxygnease，缩写为TDO，催化色氨酸吡咯环上C-2与C-3间键的裂解，这是整个反应途径的第一步，也是限速步。相比于IDO2和TDO，IDO1主要在哺乳动物细胞和真菌中发现，广泛分布于人体肝脏外的多种组织。

研究发现，IDO1的过表达与乳腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肝细胞癌和结肠腺癌等多种癌症的发生发展及转移相关。通过过表IDO1，肿瘤可以创造一个免疫抑制的微环境来阻止抗肿瘤的免疫反应。首先，IDO1高表耗竭色氨酸，导致T淋巴细胞、NK细胞不能有效完成增殖分化；其次，色氨酸代谢犬尿氨酸途径的中间产物如3-羟基邻氨苯甲酸、喹啉酸等具有抑制T细胞的功能；此外，IDO1还可以诱导调节性T细胞，即Tregs的增殖，而抑制效应T细胞的增殖。另一方面，色氨酸及其代谢产物在合成神经递质如5-羟色胺，即5-HT中也发挥重要作用，因此，IDO1的过表达也会导致一些神经疾病如阿尔兹海默症、抑郁症等的发生。

以IDO1作为靶点研发抑制剂一直是国内外研究的热点。根据化学结构，IDO1抑制剂目前可以分为五大类：1、吲哚和[5,6]稠杂环芳烃。这类抑制剂以D-1MT、NLG919为代表，具有吲哚或者[5,6]稠杂环，其中PF-06840003是一种可口服，半衰期16-19h的临床候选药，其在脑癌治疗上的应用正处于一期临床研究。2、羟酰胺类，如：INCB024360。INCB024360由Incyte公司首先发现，目前在临床三期试验，有望与PD-1/L1抑制剂联合用于黑色素瘤、肺癌等癌症治疗。3、4-苯基咪唑类，包括GDC-0919。罗氏、恒瑞医药、默克等医药公司都相继报道过该类型IDO1抑制剂。4、1,2-二氨基-和1-羟基-2-氨基-取代的芳烃，如：KHK2455。KHK2455是一类2-烷氧基-3-氨基喹喔啉的衍生物，具体结构还未公开。目前处于一期临床试验中。5、其他类，如：BMS-986205。BMS-986205是一类高效，选择性作用于IDO1的抑制剂，它的发现将IDO1抑制剂的范围扩展到了单芳基-1,2-二胺，目前处于二期临床试验中。