[发明专利]用于制备具有生物活性的肉毒杆菌神经毒素的方法及多层多相纳米颗粒

说明书

本发明涉及蛋白质制备和透皮递送领域，公开了一种用于制备具有生物活性的肉毒杆菌神经毒素的方法及多层多相纳米颗粒。该方法包括在不含动物源性成分的发酵培养基中发酵细菌肉毒杆菌，并使发酵培养基与阴离子交换培养基浆料接触，并经离心获得包含肉毒杆菌神经毒素的上清液。该方法还包括透析上清液并收集包含肉毒杆菌神经毒素的经透析溶液，使经透析溶液与阴离子交换色谱柱接触，使从阴离子交换色谱柱收集的洗脱液与阳离子交换色谱柱接触，并收集洗脱液。纳米颗粒包括最里层的水相核或油相核、水相层、油相层和最外层的乳膏层。水相层和油相层交替地包封，形成多层多相纳米细胞粒。生物分子包括肉毒杆菌神经毒素和/或透明质酸等活性分子。

技术领域

本发明涉及蛋白质制备和透皮递送领域，更具体地，涉及肉毒杆菌神经毒素A的制备和纳米包封的包含肉毒杆菌神经毒素A的生物分子和其他大分子量生物分子的透皮递送。

背景技术

肉毒杆菌毒素是细菌肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生的神经毒素，所述肉毒杆菌是一种革兰氏阳性产芽胞厌氧杆状菌，通常存在于植物、土壤、水和动物肠道中。根据肉毒杆菌抗原性的不同可区分为七种(A、B、C、D、E、F和G)。所有血清型均通过阻断神经肌肉接合处的主要神经递质乙酰胆碱的释放，麻痹肌肉来干扰神经传递。如今，肉毒杆菌神经毒素在多种治疗应用中发挥着重要作用，包括斜视、局灶性肌张力障碍、半面痉挛、各种痉挛性运动障碍、头痛、多涎和多汗症，并且其应用范围仍在迅速扩大。肉毒杆菌神经毒素也常用于美容美体应用，包括矫正整个面部、下巴、颈部和胸部的纹路、褶皱和皱纹，以及其他皮肤病学应用，例如多汗症和多痘症。2002年，美国食品和药物管理局(FDA)批准(保妥适，肉毒杆菌神经毒素A是其有效成分)用于美容美体用途，以临时减少眉间纹和抬头纹等。

产生的肉毒杆菌神经毒素(也称为肉毒杆菌全毒素，或全BoNT-A)的活性相对较低，轻链和重链通过二硫键连接形成核心小分子肉毒素(SM毒素或全毒素或者裸体毒素)，分子量约为150KDa，活性更高。图1示出了肉毒杆菌神经毒素的示意性结构。如图1中所示，肉毒杆菌神经毒素多肽链包括通过二硫键连接的分别为约100KDa的重(H)链和50KDa的轻(L)链。肉毒杆菌神经毒素A具有特异性酶活性，用于神经元内蛋白水解攻击可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)，其中酶活性由L链赋予。H链是受体结合和易位到胞质溶胶中所必需的。全BoNT-A与其他蛋白质，包括非血凝素蛋白和血凝素结合，形成更高分子量(例如960KDa)的肉毒杆菌毒素复合物(也称为BoNT-A)。与150KDa全BoNT-A(具有毒性和治疗效果)不同，肉毒杆菌毒素复合物中存在的相关蛋白质是无毒的，因而不是药理学作用所必需的。

现有技术中已有通过用含有动物源性成分的发酵培养基培养肉毒杆菌神经毒素并将其用于人类治疗。然而，动物源性产品的使用可能导致潜在的污染物(例如，来自动物源性产品的病毒)进入临床使用的制备的肉毒杆菌毒素，从而可能增加治疗应用期间的风险。

此外，由于BoNT-A(960KDa)和全BoNT-A(150KDa)的相对大的分子量，最常用的给药方式是在临床环境中的针筒注射。然而，针筒注射较为不便，使用时会造成疼痛且不安全，患者依从性较低。因此，需要开发替代方法以方便、安全且无痛地递送肉毒杆菌神经毒素，特别是在治疗、皮肤病学和药妆领域。例如，期望开发用于大分子量蛋白质的非侵入性递送方法，包括局部应用的肉毒杆菌神经毒素，例如经手施用的透皮递送，而不是针筒注射或其他使用设备的侵入性递送过程。

人体皮肤包括呈三维设置的各种组织和细胞层，例如角质层(SC)、表皮(ED)和真皮，其厚度为20μm至数百μm(例如，在一些面部区域为约250μm)。通常，可将人体皮肤视为三维精细多层(油相-水相)n系统，具有从外皮细胞到内皮细胞的确定的网络结构。因此，穿过从外皮细胞到内皮细胞的精细厚实屏障来递送尤其是大分子量的生物分子颇具挑战。

本发明所公开的肉毒杆菌神经毒素A制备方法及其纳米包封形式的透皮递送旨在解决上述一个或多个问题以及本领域的其他问题。

发明内容