[发明专利]用于制备具有生物活性的肉毒杆菌神经毒素的方法及多层多相纳米颗粒

权利要求书

1.一种用于制备具有生物活性的肉毒杆菌神经毒素的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）在发酵培养基中发酵细菌肉毒杆菌，其中所述发酵培养基不含动物源性成分；

所述不含动物源性成分的发酵培养基包含植物蛋白胨，以及右旋糖和自溶酵母泥中的至少一种；所述植物蛋白胨由马铃薯或大米中的至少一种获得；

2）使包含细菌肉毒杆菌的发酵培养基在收获时添加硫酸调节pH为3.5，形成酸泥后进行沉淀，对所得沉淀进行离心，收集沉淀物并重悬于pH为5.5的柠檬酸盐缓冲液中，对所得重悬液进行离心，将所得上清液倾析并保存，将剩余的沉淀物重悬于pH为5.5的柠檬酸盐缓冲液中，对所得重悬液进行离心，将所得上清液倾析并保存；将两次所得上清液合并，加入硫酸铵进一步沉淀，通过离心收集沉淀并重悬于pH为5.5的柠檬酸盐缓冲液中，使所得重悬液与阴离子交换介质浆料接触，并经离心获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的上清液；

3）向所述上清液中加入硫酸铵进行沉淀，将所得沉淀重悬于pH为5.5的柠檬酸盐缓冲液中，对所得重悬液进行透析，收集包含所述肉毒杆菌神经毒素的经透析溶液；

4）使包含所述肉毒杆菌神经毒素的所述经透析溶液与阴离子交换色谱柱接触；

5）重复步骤3）和步骤4），其中第二次重悬时将所得沉淀重悬于pH为7.9的柠檬酸盐缓冲液中，重复完毕后获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的洗脱液，向所述洗脱液中加入硫酸铵进行沉淀，将所得沉淀重悬于pH为7.0的柠檬酸盐缓冲液中，对所得重悬液进行透析，将所得经透析溶液与阳离子交换色谱柱接触；

6）收集包含从所述阳离子交换色谱柱获得的所述肉毒杆菌神经毒素的洗脱液；将所述洗脱液与稳定剂混合；所述稳定剂包括乙二醇、甘油和丙二醇，并且以总体积重量计，所述稳定剂在添加至洗脱液后的浓度范围为10~30 (w/v)%；其中，所述乙二醇添加至洗脱液后的浓度范围为5 ~20(w/v)%，所述甘油添加至洗脱液后的浓度范围为1~10 (w/v)%，所述丙二醇添加至洗脱液后的浓度范围为1~5 (w/v)%；

所述肉毒杆菌神经毒素是肉毒杆菌神经毒素A，使用小鼠LD₅₀测定，所述肉毒杆菌神经毒素A的生物比活性为100至400单位/纳克。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）与步骤3）之间还包括：

重复使包含所述细菌肉毒杆菌的所述发酵培养基与所述阴离子交换介质浆料接触的步骤，并经离心获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的上清液；和

合并所述包含使发酵培养基与阴离子交换介质浆料反复接触获得的肉毒杆菌神经毒素的上清液。