[发明专利]多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变检测引物及检测方法

说明书

本发明公开了一种多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变检测引物及检测方法，属于抗性突变检测技术领域。本发明的引物包括2条外引物和2条内引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.4所示。四条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性。样品提取DNA后，进行LAMP反应，反应产物经电泳或者加入荧光染料直接观察的方法实现c亚基N75S抗性突变的检快速测。本发明方法对c亚基上N75S突变的检测特异性强，并具有简便、快速、灵敏、稳定的特点，仪器要求简易，操作简便，成本低，易于在基层推广使用。

技术领域

本发明涉及抗性突变检测技术领域，特别涉及一种多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变检测引物及检测方法。

背景技术

多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)为世界性分布的真菌，可侵染超过530种植物。黄瓜棒孢叶斑病是近年来国内流行的新型病害，对黄瓜的品质和产量造成了严重损失。现行防治方法以化学防治为主，由于病原菌的高度变异，易对杀菌剂产生抗药性，导致棒孢叶斑病难以控制。

琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂(SDHI)是防治黄瓜棒孢叶斑病的常用药剂，如啶酰菌胺、氟吡菌酰胺和氟唑菌酰胺。然而，随着药剂的广泛使用造成了高选择压而被动的产生了抗药性。

琥珀酸脱氢酶即线粒体复合体II由黄素蛋白(sdhA)、铁硫蛋白(sdhB)以及两种嵌膜蛋白(sdhC和sdhD)四个亚基组成。病原菌对琥珀酸脱氢酶抑制剂的抗性机制与琥珀酸脱氢酶的其中一个亚基(B、C或D)的点突变相关联，这些突变包括c亚基上75位天冬酰胺替换为丝氨酸(N75S)。该突变型菌株对不同的琥珀酸脱氢酶抑制剂产生不同的抗性水平，并产生不同程度的交互抗性。

有效的抗性检测有助于及时做出相应的防治策略，提高防控效果，减少经济损失。因此检测菌株是否产生抗性突变，以便进行用药指导，对病害治理具有重要意义。

目前在抗性突变位点检测上，较常用的方法是分子生物学检测方法，其中以PCR最为常见，但是PCR需要30-35个循环反应(较费时)及特殊的仪器(PCR仪)且操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员较高的技术要求，另外特异性不足需要进一步测序以确定突变情况，大大限制了“针对抗性突变进行用药指导防治病害的应用”。

因此开发一种可以快速检测多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变的方法意义重大。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)最早是由Notomi,T等在2000年发明的，是一种基于高灵敏链置换技术的恒温核酸扩增方法，其工作原理为：针对靶基因的6个区域设计了4个特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶——Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶在恒温(65℃左右)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，反应产物既可通过电泳紫外观察，亦可通过荧光染色直接目测。该方法操作简便，无需特殊仪器(PCR仪)，而检测结果准确，是一种快捷而有效的检测方法。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。

未见利用LAMP方法检测抗性突变以指导病害防治的报道。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变检测引物及检测方法。本发明检测方法快速、简便、灵敏、稳定、特异性强，为多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变的检测提供了新的途径。

本发明的技术方案为：

一种用于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变检测的LAMP引物，包括2条外引物和2条内引物，其核苷酸序列分别为：