[发明专利]多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变检测引物及检测方法

权利要求书

1.一种用于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变检测的LAMP引物，其特征在于：包括2条外引物和2条内引物，其核苷酸序列分别为：

F3：CGCCCGCAGATCACCT；

B3：TGGCCGCAACCTTCGC；

FIP2：CGAAGAGGTAAAGGCCTCCGCT-GTACGCCTCGTCGTTCTG；

BIP:TTGCCTACCTGGCTGCCCC-CGGGCCATGCAGCAAC；

其中，FIP2中下划线所对应碱基为人工错配碱基。

2.如权利要求1所述用于多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变检测的LAMP引物在指导黄瓜棒孢叶斑病害治理中的应用。

3.一种多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取病原菌DNA；

2)采用权利要求1所述的LAMP引物，建立LAMP反应体系，进行环介导等温扩增；

3)LAMP反应结果判断；

向LAMP反应产物中加入0.2μL 10000×Sybr Green I，3～10分钟后观察样品颜色，如果变成黄色，则样品含有琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变；如果颜色保持染料的橙色，则样品中不含琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变；

或者，

LAMP反应产物经过电泳、染色，于凝胶成像系统中观察，如果观察到呈弥散状的核酸泳带，则样品含有琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变；否则样品中不含琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变。

4.如权利要求3所述多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变的检测方法，其特征在于，步骤1)中，病原菌DNA的提取过程为：取菌丝在液氮中研磨至粉末，采用病原菌真菌DNA提取试剂盒提取病原菌DNA。

5.如权利要求3所述多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述LAMP反应体系以10μL计，包括：10×ThermoPol buffer 1.0μL、10μM的F3 0.2μL，10μM的B3 0.2μL，20μM的FIP2 0.8μL，20μM的BIP 0.8μL、10mM的dNTPs 1.0μL、100mM的MgSO₄0.4μL、8000U/mL的Bst DNA聚合酶0.5μL、模板DNA 0.5μL、5M的甜菜碱1.6μL、dd水3μL。

6.如权利要求3或5所述多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变的检测方法，其特征在于：步骤2)中，环介导等温扩增的反应条件为63℃恒温1h，80℃恒温10min。

7.如权利要求3所述多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶c亚基N75S抗性突变的检测方法，其特征在于，步骤3)中，LAMP反应产物的电泳、染色为：5μL LAMP反应产物经3％琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液和120V电压条件下电泳30min，在1×GelStain中染色。