[发明专利]一种可获取高质量固体核磁共振谱图的RNA固体样品制备方法及其结构检测方法

说明书

本发明涉及基于核磁共振技术生物大分子结构检测技术领域，尤其涉及一种可获取高质量固体核磁共振谱图的RNA固体样品制备方法及其结构检测方法：将至少一种碱基由¹⁵N和¹³C进行标记的RNA样品在氘代缓冲液中升温退火，使其正确折叠；在上述RNA溶液中依次加入一价或者二价阳离子水溶液和2‑3倍体积预冷的氘代无水乙醇；将上述体系于低温静置过夜，离心弃去上清，用少量预冷氘代乙醇清洗底部沉淀；使用固体核磁共振波谱仪对沉淀样品进行检测；收集并分析检测图谱。本发明简单、快速、具有普适性，无需结晶及其他繁琐的操作步骤，即可以获得高分辨率的固体核磁谱图。

技术领域

本发明涉及基于固体核磁共振技术生物大分子结构检测技术领域，尤其涉及一种可获取高质量固体核磁共振谱图的RNA固体样品制备方法及其结构检测方法。

背景技术

RNA是生物体必需的生物大分子，在生命活动的诸多过程中均发挥着至关重要的调控作用。然而，绝大多数RNA的功能未知，需要结构研究进一步阐释其精确的生理功能。RNA分子柔性大、负电荷多、结晶困难，限制了X-ray晶体衍射技术解析RNA结构。液体核磁共振技术可以在水溶液中研究RNA，无需结晶，但受到分子量的限制，不适合大分子量RNA的结构分析。因此发展新的RNA结构解析方法至关重要。

固体核磁共振技术是RNA结构研究的新技术，其特点是该技术可以研究不同形式的样品，包括，尺寸较小的微晶样品(Marchanka A,et al.Nature Communications,2015,6,7024.)、冻干粉末(Riedel K,et al.Journal of Biomolecular Nmr,2005,31，49-57.)等，并且有望研究非均相聚合态RNA，这类分子形成的聚合态，无法利用传统的结构生物学手段，如X-ray晶体衍射技术或液体核磁共振技术研究。

获取高分辨RNA固体核磁共振谱图是拓展固体核磁共振研究RNA应用范围的主要技术瓶颈，特别是缺少一种普适性的、能获取高质量RNA固体核磁共振谱图的RNA固体样品制备方法。目前常见的RNA样品制备方法是冻干和结晶，然而冻干样品的固体核磁共振谱图分辨率差、谱线很宽，无法获得高质量的固体核磁共振谱图。结晶RNA的固体核磁共振谱图质量较高，然而RNA普遍存在结晶困难，条件筛选极其繁琐复杂的问题，不具有普适性和实用性。因此，发展一种简单、普适、并可获得高质量固体核磁共振谱图的RNA样品制备方法，是固体核磁共振研究RNA的重要需求。

发明内容

基于上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明提供了一种可获取高质量固体核磁共振谱图的RNA固体样品制备方法及其结构检测方法，在稳定同位素标记的RNA溶液中加入乙醇与水的混合液，通过控制乙醇和水的比例，实现RNA的快速沉淀，离心收集获取适合于固体核磁共振研究的RNA固体样品；进一步使用固体核磁共振波谱仪对上述方法制备的RNA样品进行检测，最后收集并分析相关检测图谱。本发明所述制备方法操作简单、快速，所制备的RNA样品经固体核磁共振波谱仪检测获取的谱图分辨率高，并且突破了固体核磁方法研究对RNA结晶的需求，普适性强。

本发明的实现原理如下：

魔角旋转固体核磁实验的谱图分辨率主要受到两方面因素的影响，包括谱线均匀展宽(homogeneous broadening)和非均匀展宽(inhomogeneous broadening)。谱线均匀展宽主要来源于原子核之间的偶及耦合相互作用，与相互作用原子核的磁旋比成正比。提高魔角旋转的转速或利用同位素稀释的方法，可以有效降低谱线的均匀展宽。由于质子间的强偶极耦合是RNA固体核磁谱图¹H谱线展宽的主要因素，利用²D部分取代¹H原子，可以利用²D相对于¹H较低的磁旋比(¹H的磁旋比是²D的磁旋比的6.5倍)，降低未被取代¹H原子的谱线线宽。