[发明专利]非人哺乳动物模型及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一种敲入有雄激素受体‑荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用。本发明构建的敲入有雄激素受体‑荧光素酶的非人哺乳动物模型可作为治疗去势抵抗性前列腺癌以及多囊卵巢综合征等与雄激素受体表达异常相关疾病的药物的筛选平台，可实现简单，迅速，大规模的筛选调控雄激素受体基因表达的药物；可以在不伤害非人哺乳动物的前提下，利用荧光成像仪直接活体检测雄激素受体的表达和分布。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种非人哺乳动物模型及其构建方法和应用。

背景技术

雄激素作为一种控制男性发育和成年男性表型以及维持生殖功能的类固醇激素，具有重要的生理学意义，而其发挥其生理学功能主要是通过与雄激素受体(AR)结合，从而激活雄激素受体的转录活性来调控下游基因的表达。若无雄激素受体，则雄激素对组织无刺激反应。

雄激素受体(AR)，类固醇激素受体的一种，也属于核受体超家族中的一员。一般由四个结构域组成：N端转录激活区(NTD)、DNA结合区(DBD)、铰链区和配体结合区(LBD)。

目前研究表明，雄激素受体(AR)介导的雄激素/雄激素受体信号不仅在参与胚胎发生、精子发生、性行为和发育过程中男性特异性表型的形成中发挥重要功能。同时这种信号也被证明在女性生殖器官的发育及其功能中起着重要的作用，如卵巢卵泡发育、胚胎植入和胚胎移植，子宫和乳房发育。因此，雄激素受体表达水平的异常经常与各种疾病的发生密切相关，例如去势抵抗性前列腺癌，多囊卵巢综合征(Polycystic Polycystic ovarysyndrome，PCOS)等。

其中多囊卵巢综合征(PCOS)，作为妇女在生育年龄常见的一种复杂的内分泌及代谢异常所致的疾病，目前已经影响全世界6％-20％的妇女，且近年来其发病率仍在不断攀升。PCOS的特征为：高雄激素血症、排卵功能障碍和多囊卵巢形态；大多数PCOS患者还会伴有以胰岛素抵抗和代偿性高胰岛素血症为特征的代谢功能障碍，且有增加2型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他妊娠相关并发症、静脉血栓栓塞、心脑血管疾病，子宫内膜癌的患病风险。由于PCOS临床表征不均一且具有异质化，因此其病因和发病机制尚未完全阐明。因此对于寻找能够有效治疗PCOS的药物的需求也越来越大。

目前，用于治疗PCOS的方法都是针对患者的不同诉求对不同临床表征的对症治疗。其中，抗雄激素治疗就是针对在PCOS发生和发展过程中起关键病因之一的高雄激素血症作为靶标的，而雄激素主要依赖于雄激素受体发挥作用，有研究表明，PCOS大鼠中雄激素水平的升高也会雄激素受体水平的升高。因此，对于调控雄激素受体的表达水平也可以作为治疗PCOS的新策略。

然而，对于筛选调控AR表达的变化的药物，尤其是AR蛋白水平的变化，目前无论利用实时定量RT-PCR或者western blot的方法进行药物筛选，都费时费事费力费钱。实时定量PCR至少需要一天的时间来检测AR的变化，而western blot至少需要两天的时间来进行检测分析，耗时长，检测效率低。

因此，构建一个可以快捷、准确地筛选调控AR表达用于治疗PCOS的药物的平台显得尤为重要。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种敲入有雄激素受体-荧光素酶的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种非人哺乳动物模型的构建方法，包括以下步骤：

将Cas9 mRNA、gRNA和同源重组载体显微注射到非人哺乳动物的受精卵中，以在非人哺乳动物的雄激素受体基因终止密码子位点前，通过同源重组定点敲入串联肽-荧光素酶表达框；

所述gRNA包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的两个条序列；