[发明专利]一种多引物oligo探针的制备方法

说明书

本发明公开了一种多引物oligo探针的制备方法，利用生物信息学途径设计oligo序列，根据其在基因组的位置划分为独立探针，在所有探针的oligo序列的5’端加上相同引物序列F1，不同探针的oligo序列的3’端加上不同的引物序列(R1‑R8)用以探针的扩增和区分，通过人工合成可一次制备8个不同的单链oligo探针。该方法可将一个oligo探针序列库拆分为8个探针，消除了oligo探针库无法拆分的弊端，本发明的多引物oligo探针制备方法提高了FISH技术在更为精细的植物分子细胞遗传学研究中的应用能力，有助于FISH技术的进一步发展。

技术领域

本发明涉及FISH技术探针制备与应用领域，具体涉及一种多引物oligo探针的制备方法。

背景技术

荧光原位杂交技术(FISH)兴起于1982年，经过三十多年的发展已经成为植物分子细胞遗传学研究中最重要的手段之一。其原理是将已知序列制备成带有标记物的探针，基于碱基互补配对的原则，与细胞或组织中的核酸进行杂交，通过特定波长光激发标记物实现对已知序列的精准定位。目前，FISH技术在植物染色体组学和基因组学研究中应用广泛。但是，在非模式的植物中，可用于研究应用的DNA探针是十分少量的，并且其开发工作也是十分困难和耗费人力的。这极大地阻碍了FISH技术在植物染色体组学和基因组学研究中的应用。几十年来随着技术的发展革新，其所依赖的DNA探针也有了更多可供选择的类型。如重复序列DNA、大的插入片段BACs和单拷贝基因序列等。探针类型的多样化扩大了FISH技术在植物染色体组学和基因组学研究中的应用范围。但是对于倍性较高、染色体数目较多的植物物种，开发可用于实验研究的DNA探针仍是十分艰难的。近年来由于DNA合成技术的迅速发展，数以万计的寡核苷酸(oligos)大规模合成变为了可能。人工合成带有标记的寡核苷酸(oligos)探针结合FISH技术已经广泛应用于小麦、水稻、土豆和黄瓜等重要农作物的染色体识别、核型进化和基因检测等研究中。Oligo探针具有灵敏度高、特异性强等特点，并且可以根据研究需要从重复序列或者单拷贝DNA序列进行定向设计，这极大的加强了FISH技术在植物分子细胞遗传学研究领域的应用能力。但是，目前oligo探针的制备方式是每个oligo序列库采用单一引物对扩增制备，其缺点在于每个oligo序列库只能制备成一个探针，探针的无法拆分性极大的限制了oligo-FISH技术在植物分子细胞遗传学研究中更精细的应用。

现代植物染色体组学和基因组学的深入研究需要更为精细的FISH技术作为支撑。本发明开发了一种多引物oligo探针制备方法，可将一个大的oligo探针序列库拆分为8个小探针分别合成。这极大的加强了oligo-FISH技术在更为精细的植物分子细胞遗传学研究中的应用能力。

发明内容

本发明的首要目的是克服上述现有技术的不足和缺点，提供了一种多引物oligo探针的制备方法，提高FISH技术在更为精细的分子细胞遗传学研究中的应用能力。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种多引物oligo探针的制备方法，利用生物信息学技术设计oligo序列并在所有oligo序列的5’端加上引物序列F1，不同探针中oligo序列的3’端加上不同的引物序列R1-R8，通过不同引物对组合将1个oligo探针序列库的8个oligo探针区分扩增，其引物序列分别为SEQ ID NO.1-9所示。

一种多引物oligo探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)以基因组为基础去除重复序列并将剩余序列设计成59bp的oligo序列。

(2)将oligo序列比对回基因组去除含有多个比对位点的序列，并将剩余序列根据区间划分为独立探针。

(3)每个oligo探针中oligo序列的5’端加上引物序列F1，在3’端加上不同引物序列R1-R8，所有oligo序列混合构建为1个oligo探针序列库。