[发明专利]一种多引物oligo探针的制备方法在审
| 申请号： | 201910545475.1 | 申请日： | 2019-06-22 |
| 公开（公告）号： | CN110205357A | 公开（公告）日： | 2019-09-06 |
| 发明（设计）人： | 王凯;孟状 | 申请（专利权）人： | 福建农林大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6811 | 分类号： | C12Q1/6811 |
| 代理公司： | 北京盛凡智荣知识产权代理有限公司 11616 | 代理人： | 李丽君 |
| 地址： | 350002 福*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 探针 制备 多引物 引物序列 细胞遗传学研究 生物信息学 途径设计 应用能力 植物分子 基因组 序列库 单链 扩增 精细 | ||
1.一种多引物oligo探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)oligo探针序列的设计：通过Repeat Masker软件过滤基因组重复序列，将剩余序列设计成简短oligo片段，通过BLAST去除含有多个比对位点的oligo片段，得到单一拷贝的oligo序列，根据oligo序列在基因组的位置划分区间，每个区间的oligo序列组成一个oligo探针，在所有探针的oligo序列的5’端加上相同的引物序列F1，在不同探针的oligo序列的3’端分别加上不同的引物序列R1-R8；
(2)Oligo探针的制备：以oligo探针序列库为模板，5’端通用引物F和3’端不同的引物序列R1f-R8f组成不同引物对，通过PCR的方式扩增得到8个不同的oligo探针DNA，再体外转录成RNA，再用带有荧光标记物的3’端引物序列R1f-R8f进行反转录得到DNA/RNA杂链，再水解掉杂链中的RNA链，得到8个不同的单链oligo探针。
2.如权利要求1所述的一种多引物oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，引物序列F1如SEQ ID NO.1所示，引物序列R1-R8分别如SEQ ID NO.2-9所示。
3.如权利要求1所述的一种多引物oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，每个oligo序列的长度为59bp，每个oligo探针由1568条oligo序列组成，8个不同的oligo探针组成1个oligo探针序列库。
4.如权利要求1所述的一种多引物oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，5’端引物F的序列为保护碱基GGAGGCCGGAGAAT+F1如SEQ ID NO.10所示。
5.如权利要求1所述的一种多引物oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，3’端不同的引物序列R1f-R8f为步骤(1)中oligo序列的3’端上不同的引物序列R1-R8的反向互补序列。
6.如权利要求1所述的一种多引物oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述PCR扩增体系为：5 X HF Buffer，50mM Mgcl2，10mM dNTP，10ug/ulBSA，1mM上游引物，1mM下游引物，1ng/ul oligo探针序列库，2U/ul Phusion HF polymerase。
7.如权利要求6所述的一种多引物oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，PCR扩增体系中，oligo探针序列库的用量为4ng。
8.如权利要求1所述的一种多引物oligo探针的制备方法，其特征在于：所述PCR扩增条件为：98℃预变性2min；98℃变性15s，60℃退火30秒，72℃延伸30，35个循环；72℃终延伸5min，10℃保存。
9.如权利要求1所述的一种多引物oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所用的荧光标记物为间接标记物digoxin或biotin。
10.如权利要求1所述的一种多引物oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所用的荧光标记物为直接标记物6-FAM或TAMRA。
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