[发明专利]调味品中酵母菌的检测方法

说明书

本发明公开了一种调味品中酵母菌的检测方法。该检测方法包括：采用实时荧光定量PCR检测待检测调味品中酵母菌的特异性基因。本发明的实时荧光定量PCR检测方法检测调味品中酵母菌，大大缩短了调味品中酵母的检测时间，且该方法特异性好，灵敏度高，为调味品生产过程及产品中酵母菌的快速、灵敏检测提供了有效的技术手段。

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，具体而言，涉及一种调味品中酵母菌的检测方法。

背景技术

传统发酵调味品通常盐分含量较高，一般细菌很难在其中繁殖，但是酵母菌能够耐高渗透压，很容易造成调味品的产气、长白膜等现象(酱油涨袋原因及其预防措施，吴瑞华，赵青《江苏调味副食品》2004年第21卷第6期)、防止大豆酱胀袋、产白膜、酸度超标的方法，刘井权，郑喜群，柴华，孙玉坤，单会君，《中国调味品》2010年第1期总第35卷)，因此为了防止调味品变质，需要在产品生产过程中控制酵母菌指标。

目前酵母的检测方法主要是参考国标GB 4789.15《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》，但是其中所用培养基孟加拉红培养基或者PDA培养基，培养时间长，需要5d报告最终结果，且不适合调味品高盐环境中微生物的生长(胀罐酱油中耐渗透压酵母菌分离及鉴定[J]，欧阳友生，谢小保，陈娇娣等，《微生物学通报》，2005，32(4)：120-123)。

因此，亟需开发一种能够快速检测调味品中酵母的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种调味品中酵母菌的检测方法，以解决现有技术中调味品中酵母菌检测时间长的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种调味品中酵母菌的检测方法。该检测方法包括：采用实时荧光定量PCR检测待检测调味品中酵母菌的特异性基因。

进一步地，检测特异性基因用到的引物包括如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，探针包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

进一步地，检测方法具体包括：S1，取待检测调味品加入到增菌液中进行培养；S2，提取增菌液中的DNA；以及S3，以DNA为模板采用实时荧光定量PCR检测酵母菌的特异性基因。

进一步地，增菌液为葡萄糖150～300g、酵母粉5～20g、NaCl 3～8g和氯霉素0.05～0.1g，加水至1000mL，灭菌。

进一步地，培养为28℃，150～200rpm震荡培养20～24h。

进一步地，所以S1中，待检测调味品与增菌液的比例为1:7～9，优选为，1:9。

进一步地，S2具体包括以下步骤：1)取1mL增菌液，8000～10000rpm离心5min，去除上层液体，获得第一菌体沉淀；2)在菌体沉淀中加入80～100mg 100目无菌石英粉，锥形研磨棒研磨至少3min，破碎细胞；向菌体沉淀中加入500μL 1.2M山梨醇缓冲液，1mg蜗牛酶，37℃水浴1h，12000r/min，离心10min，弃上清，得到第二菌体沉淀；其中，山梨醇缓冲液是用0.1M pH7.4的磷酸盐缓冲液配置；3)向第二菌体沉淀中加入100μL裂解液和20μL蛋白酶K，振荡至菌体完全悬浮，55℃水浴45min；4)加入250μL 6mol/L NaCl溶液和等体积的24:1的氯仿：异戊醇混合液，混匀10min后，13000rpm离心5min；5)取上清加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，静置5min后，13000离心5min；6)废弃上清，用500μL 70％乙醇洗涤沉淀，13000rpm离心2min；7)重复上步骤6)一次，废弃上清，室温干燥5～10min；加25～50μL无菌水溶解DNA沉淀。

进一步地，裂解液包括0.5M TE缓冲液pH 8.0、1％CTAB、2％巯基乙醇、卵磷脂酶200U，以及体积比为24:1的氯仿：异戊醇混合液。