[发明专利]一种海参糖胺聚糖含量的测定方法

说明书

本发明公开了一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，是将示差折光检测器与高效液相色谱联用，利用分子尺寸排阻色谱柱‑HPLC分离样品，示差折光检测器检测目标物信号，然后进行定量分析。本发明适用于海参糖胺聚糖和解聚海参糖胺聚糖的含量检测，方法线性范围宽，精密度、准确度以及耐用性均能符合方法学要求。

技术领域

本发明涉及医药成分检测技术领域，具体涉及海参糖胺聚糖含量的测定方法。

背景技术

海参糖胺聚糖(Holothurian glycosaminoglycan,简称HG)，是从海参中提取的一种含岩藻糖支链的硫酸糖胺聚糖，其结构与肝素(Heparin)这种最为人所熟知的糖胺聚糖近似。HG(包括低分子的解聚海参糖胺聚糖，Depolymerized holothurianglycosaminoglycan,简称DHG)的重复组成单元包括氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖以及它们的硫酸酯基。现代研究证实，HG与DHG具有抗凝抗栓作用，能抑制肿瘤的发生和转移，应用前景广阔。

传统的糖胺聚糖含量的测定方法有3.5-二硝基水杨酸法(简称DNS法)、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法以及色谱法等。蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法，都需要将糖胺聚糖样品在浓硫酸作用下进行水解和脱水，然后再与蒽酮或者苯酚结合形成有色的化合物，于最大吸收波长处测定其吸光度。这两种方法的缺陷在于：样品处理比较麻烦，并且试剂稳定性较差，结果重复性差。DNS法也是需要将糖胺聚糖样品先进行水解，然后再与3.5-二硝基水杨酸生成棕红色的氨基化合物，通过比色法测定样品中的糖胺聚糖含量，该检测方法需对水解时间严格控制，否则会影响结果的准确性。色谱法主要包括测气相色谱法和液相色谱分析方法。气相色谱法一般需要先将糖胺聚糖进行水解，然后用衍生物法增加多糖样品的挥发性，样品处理过程复杂。

液相色谱分析方法已经成为多糖分析的常规分析方法，常用于对多糖和单糖进行常规的分子量分布分析和定性分析。常用的检测器有示差折光检测器(Differentialrefractometers，RID)、蒸发光检测器(Evaporative lightscattering detector，ELSD)、荧光检测器(Fluorescence detector，FLD)、电化学检测器(Electrochemical detector，ED)和紫外检测器(Ultraviolet detector,UV)。其中示差折光检测器和蒸发光检测器检测器在检测样品时，无需衍生化，具有稳定性高，操作简单等特点，而其他检测器则往往需要糖样品进行衍生化，操作复杂，重复性和稳定性差。

示差折光检测器的是一种连续检测样品流路与参比流路间液体折光系数差值的检测器，是根据折射原理设计的，检测池有参比和测量两个池室。当被测试的样品溶液流过测量池时，引起折射率变化使照在双光电阻上的光束发生偏转，使双光敏电阻阻值发生变化，此时由电桥输出讯号，即反映了样品浓度的变化情况。示差折光检测器是一种通用型检测器，其优点是能够对糖类进行检测，并且稳定性好，易于操作。与蒸发光检测器相比，示差折光检测器具有响应稳定，适用范围广，更适合于定量分析等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，其采用带示差折光检测器的分子尺寸排阻—高效液相色谱仪，方法简单、准确性高和重复性好。

为实现上述目的，所采用的技术方案如下：一种海参糖胺聚糖含量的测定方法，示差折光检测器与分子尺寸排阻—高效液相色谱仪联用，利用分子尺寸排阻凝胶色谱柱分离样品，示差折光检测器检测目标物信号，包括以下步骤：

一、标准曲线工作溶液配制：称取对照品，用高效液相色谱流动相配制成对照品储备液，再量取对照品储备液，用高效液相色谱流动相稀释成若干梯度浓度的标准曲线工作溶液，标准曲线工作溶液的浓度范围为0.1-30mg/mL；

二、供试品溶液配置：称取供试品，用高效液相色谱流动相配制成供试品溶液，供试品溶液浓度范围为0.1-30mg/mL；