[发明专利]一种FRET-ICT型β-半乳糖苷酶荧光探针及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种检测细胞和组织中的β‑半乳糖苷酶的荧光探针，所述荧光探针CG，其化学结构式如下所示。本发明还公开了所述该荧光探针的制备方法及其在检测细胞和组织中的β‑半乳糖苷酶的应用。本发明的探针随β‑半乳糖苷酶含量的增加荧光强度呈比率型显著增强，利用本发明的探针通过荧光成像技术检测细胞内β‑半乳糖苷酶的含量。

技术领域

本发明涉及一种检测细胞中的β-半乳糖苷酶的荧光探针及其应用，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶，是一种能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶，广泛存在于动植物细胞中，在维持正常的生命活动中具有举足轻重的作用。β-半乳糖苷酶活性及含量的异常通常与癌症的发生有着密切的关系，此外,在遗传学领域中对人类β-半乳糖苷酶缺陷病的诊断和基础研究也是重要的指征，研发高效的检测手段来实现对生物体系中β-半乳糖苷酶的活性检测和成像对深入研究重大疾病的发病机制具有不可忽视的作用。传统的酶活性分析检测手段有比色法、电化学法等,但因各自的局限性都无法实现对生物体系内β-半乳糖苷酶的含量进行实时原位无损的检测。近年来，荧光探针法因其具有选择性好、灵敏度高、操作简便，可实现实时快速、原位无损检测、高时空分辨率成像等优势,已广泛用于活细胞水平离子及小分子的识别及细胞成像,同时也成为生物体系中β-半乳糖苷酶活性检测与可视化成像的一种重要手段而备受关注，基于酶的催化专一性特点,β-半乳糖苷酶可以特异性识别β-半乳糖苷键。因此,我们设计了一种基于FRET机制的比率型β-半乳糖苷酶荧光探针,从而实现对β-半乳糖苷酶的特异性检测。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种β-半乳糖苷酶荧光探针（CG）及其应用。利用本发明的探针通过荧光成像技术检测细胞中的β-半乳糖苷酶，可用于评价和研究细胞内的β-半乳糖苷酶的生理功能。

一种检测β-半乳糖苷酶的比率型荧光探针，探针分子的分子式为：C₃₉H₄₂N₄O1₂，结构如下：

。

所述的制备方法，按照以下步骤进行：

（1）将化合物1（1 eq）、化合物2 (7-(二乙胺基）-2-氧代-2-苯并吡喃-3-酰胺哌嗪,1eq）、EDC（1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺, CAS:1892-57-5; 2 eq）、和HOBT（1-羟基苯并三唑, CAS:2592-95-20.5 eq）溶于DMF溶液中，室温搅拌反应10 min后加入DIEA（100μL），氮气保护反应4 h，硅胶色谱柱纯化得到淡黄色固体3，反应方程式为：

；

（2）将化合物3（1 eq）、Na2SO4（2.5 eq）和Cs2CO3（5 eq）溶于无水乙腈溶液中，然后将化合物4 (2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃糖溴化物，CAS: 3068-32-4)滴加进反应液中在氮气保护环境中室温搅拌反应24 h，经过硅胶色谱柱纯化得到淡黄色固体粉末A，反应方程式为：；

（3）在100 mL圆底烧瓶中，将物质A（200mg）溶于甲醇溶液中，37 ℃保温5 min后加入2mL的甲醇钠搅拌反应2 h，然后冰水中放置析出固体，过滤干燥得到黄色固体CG，反应方程式为：。

更多的，上述的检测细胞和组织中β-半乳糖苷酶的荧光探针的应用，其特征在于，该荧光探针可以应用于生物中的β-半乳糖苷酶的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，细胞成像检测。

上述应用中：所述荧光探针能专一识别β-半乳糖苷酶，并且以比率型荧光增强的方式实现对β-半乳糖苷酶的识别，尤其是它还可以识别活组织中的β-半乳糖苷酶。