[发明专利]一种AFFT2细胞的构建方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种AFFT2细胞的构建方法。该方法将细胞用TCR－T技术进行了改造，改造后的T细胞采用抑制性信号分子抗体药物进行体外封闭，从而有效的提高T细胞抗肿瘤的能力，经过AFFT2方案改造的细胞，识别肿瘤抗原的特异性T细胞比例为70％以上。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种AFFT2细胞及其制备方法。

背景技术：

目前，在肿瘤的特异性免疫治疗方面，现有的LAK、DC、CIK、DC-CIK细胞和方法基本被证明是无效的，而NK、CAR-NK、TIL、等细胞技术还有待成熟，CAR－T细胞在安全性和实体瘤治疗中还有缺陷。

现有技术一般通过改造DC细胞，由DC递呈T细胞产生特异杀伤。有些实验室在尝试用病毒做为载体的方法进行转染递呈T细胞，诱导T细胞的特异性杀伤。我们也曾用突变混合多肽直接刺激PBMC，诱导T细胞。还有实验室利用TCR-T技术，靶向递呈MAGE A3抗原。

以上治疗方法并不成熟，尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多，但在具体实施过程中还有许多问题，缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。另外，有的虽然进行了抗原体外冲击，但没有进行体外共培育和体外扩增，让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤微环境，因此，很难起到预期的效果。也有的虽然也可以体外递呈和共培育，但靶点单一(MAGE-3)，仅对非小细胞肺癌等个别癌种起效。虽然也有尝试慢毒为载体的方法进行转染递呈，但安全性、方便性不如多肽方式。而简单混合多肽的直接刺激，虽然简单方便，但效率较低。特异性精准多肽的二次刺激不如T细胞受体转导的肿瘤特异性抗原更直接。现有的TCR-T在治疗血液肿瘤和实体肿瘤的解决方案中，缺乏覆盖更多瘤种的精准的TCR。

上述方案均没有考虑T细胞的自我防护技术，使得数量不多的特异性T细胞直接面对强大的肿瘤微环境。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将提供一种AFFT2细胞的构建方法，该方法将细胞用TCR－T技术进行了改造，改造后的T细胞采用抑制性信号分子抗体药物进行体外封闭，从而有效的提高T细胞抗肿瘤的能力。

所述AFFT2细胞的构建方法，包括以下主要步骤：1)抽取患者外周血，进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点，进行抗原表位预测并合成突变多肽；2)使用外周血制备永生化DC，并负载所述突变多肽，与PBMC共孵育，获得AFF细胞；3)用突变多肽作为抗原刺激AFF细胞，筛选获得精准多肽；4)以所述精准多肽负载永生化DC细胞并与PBMC共孵育，制备AFF’细胞；5)以所述精准多肽作为抗原刺激所述AFF’细胞，筛选获得能够识别所述精准多肽的特异性T细胞，通过测序得到特异性细胞的高频TCR序列；6)从PBMC中分离CD8+T细胞，敲除原有TCR并进行高频TCR的表达，构建TCR-T细胞；7)将上述TCR-T细胞采用抑制性信号分子的单抗药进行封闭处理，制备得到AFFT2细胞。

AFFT2细胞具体制备步骤如下：

1、全外显子测序

使用人源外周血进行ctDNA测序或者以肿瘤组织进行全外显子测序，将测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变位点；

所述外周血也可以是市售工程细胞系，如H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞等，对其进行全外显子测序；

2、抗原表位预测

(1)以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将这段21个氨基酸的多肽作为“潜在抗原表位”；