[发明专利]一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法

说明书

本发明涉及一种缺失型人角质细胞生长因子‑1的重组制备方法，其包括用于获取缺失型人角质细胞生长因子‑1的重组表达方法、用于形成重组缺失型人角质细胞生长因子‑1的102位和106位间的一对二硫键的二硫键形成方法，其中，缺失型人角质细胞生长因子‑1的氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1。本发明的重组表达方法，通过采用含T7启动子或BAD启动子的表达载体与表达宿主组成表达体系，直接表达得到的缺失型人角质细胞生长因子‑1，其N端无甲硫氨酸，无需工具酶酶切；本发明的二硫键形成方法，通过采用半胱氨酸作为添加剂，重组缺失型人角质细胞生长因子‑1的102位和106位间正确形成一对二硫键配对形成效率大于95％，具有与天然型KGF‑1相同的生物效价和生物作用。

技术领域

本发明涉及生物技术的技术领域，尤其是涉及一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法。

背景技术

角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor，KGF)是Rubin JS等人1989年从胚胎肺成纤维细胞培养上清液中发现的，为成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor，FGF)家族一员，又称FGF-7。由于其具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的能力，故命名为角质细胞生长因子。

人角质细胞生长因子(hKGF)为基因编码194个氨基酸残基的蛋白质，包含一个供分泌的信号肽(由31个氨基酸残基组成)和位于N端的糖基化位点。成熟的hKGF由163个氨基酸组成，由于受糖基化的影响，分子量约为26-28kDa。

天然的hKGF稳定较差，活性容易受环境影响，生物半衰期短，在温和的温度下也容易聚合。根据现有文献(Osslund TD etAl，Protein Sci，1998，7：1681-1690；Hsu E etAl，Protein Eng Des Sel，2006，19：147-153和美国专利US 5677278)报道，N端缺失23个氨基酸且形成Cys102-Cys106二硫键的缺失型人角质细胞生长因子-1(记为△N23KGF-1)，其稳定性较高，同时体内外生物学作用和活性也保持不变。

授权公告号为CN100545264C的中国专利公开了一种大肠杆GST菌融合表达制备截短型重组人角质细胞生长因子的方法，该方法先通过表达获得GST-KGF融合蛋白，再引入凝血酶或肠激酶酶切，以此获得截短型重组人角质细胞生长因子(KGF)，最后在纯化工艺中引入了肝素亲和柱纯化。该制备方法需要对GST-KGF融合蛋白进行酶切加工，且存在凝血酶或肠激酶和肝素残留的风险，有待改进。

授权公告号为CN1161380C的中国专利公开了一种角化细胞生长因子的表达、纯化制备方法，根据其公开的氨基酸序列表可得，该方法表达得到的KGF及其类似物的氨基酸序列的N端含有甲硫氨酸，容易引起免疫反应，影响该目的蛋白成药，因此需要对该目的蛋白的N端进行加工修饰，有待改进。

张增涛等.重组人角质细胞生长因子I型缺失突变体二硫键配对与生物活性.重庆理工大学学报(自然科学版)，2010年，24(5).第44至第53页公开了一种二硫键形成方法，该方法采用重组大肠杆菌可溶性表达的△23KGF-I经铜离子处理形成Cys102-Cys106配对的二硫键，由于铜离子存在与第40位Cys络合的可能性，仅Cys102-Cys106配对的△23KGF-I的产率不高，有待改进。另一方面该文献公开了所获得的△23KGF-I具有更高的刺激上皮细胞活性的作用，适用于放化疗后的口腔黏膜的保护、急性肝损伤的治疗。

发明内容

针对现有技术中所存在的上述不足，本发明的第一个目的在于提供一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，达到了获得具有102位和第106位间的一对二硫键的缺失型人角质细胞生长因子-1的目的，其解决了现有方法中表达得到的目的蛋白需要加工修饰的问题，且有利于提高102位和第106位间的一对二硫键配对形成效率。