[发明专利]一种DNA产物的脱盐处理方法及单链DNA的制备和制备试剂盒

说明书

本发明公开一种DNA产物的脱盐处理方法及单链DNA的制备和制备试剂盒。该DNA产物脱盐处理方法，将琼脂糖、葡萄糖和无菌水混合加热熔融，然后冷却形成凝胶，并使得所述的凝胶上形成有可放入液体的空间，将DNA产物置于所述空间，冰上处理60‑120min，即可。脱盐后的DNA产物基本没有损耗，同时该脱盐处理方法操作简单，对环境、设备和人员素质的依懒性低。本发明提供序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的载体，解决了现有载体的酶切位点对制备ssDNA的限制性问题。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种DNA产物的脱盐处理方法及单链DNA的制备和制备试剂盒。

背景技术

成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-相关联的(Cas)体系(CRISPR-Cas系统)用于哺乳动物细胞中所需基因组位点处的基因编辑。在CRISPR-Cas系统中，Cas9核酸酶通过与指导RNA(gRNA)复合而靶向至与gRNA互补的DNA区域，并切断DNA双链，细胞随即展开修复。如果修复过程中没有可供修复的DNA模板，修复的过程会引入大量的随机突变；如果提供修复模板，就有可能将修复模板整合在DNA中，从而引入设计的突变类型。本领域技术人员发现以单链脱氧核糖核酸(ssDNA)为同源重组修复模板进行基因敲入，具有随机插入概率低、编辑效率高等优势。

ssDNA的制备方法主要有T7逆转录法、核酸外切酶法、变性高效液相色谱法、磁珠捕获法、不对称PCR、切刻酶制备法等。

日本BiodynamicsLaboratoryInc提供的长单链DNA(ssDNA)制备试剂盒，使用Nicking切口酶法制备高纯度且有正确序列的长单链DNA(ssDNA1500base或3000base)。该试剂盒制备ssDNA的方法包括步骤：(1)对附加了目的DNA片段的质粒的MSC(多克隆位点)中两个切口酶位点之间或者是切口酶位点与限制酶位点之间进行克隆；(2)对克隆位点使用相应的切口酶和限制性内切酶消化质粒；(3)消化后的质粒经过乙醇沉淀脱盐处理后，通过附加的变性凝胶上样缓冲液进行变性，进行琼脂糖凝胶电泳；(4)切出跑在前端的条带，纯化后得到目的ssDNA。消化后质粒无法直接变性得到ssDNA，需要在变性前，采取乙醇沉淀法等方法对其进行脱盐处理。其中，乙醇沉淀法一方面会造成酶切产物的损耗，另一方面对操作人员素质和所用设备依赖度高。且对消化后质粒进行变性处理时需要加热，而加热容易导致ssDNA的降解。

上述试剂盒所用载体pLSODN将所有可能用到的酶切位点全部添加到其序列中，这会导致：(1)目标序列插入时需根据所用酶切位点选择相对应的酶进行酶切连接，操作繁琐，不利于大规模制备；(2)无法使用载体中存在的切刻酶和限制性内切酶的酶切位点，限制了ssDNA的制备范围；(3)限制了ssDNA的长度，只能制备长度为200-3000nt的ssDNA。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，从而提供一种DNA产物的脱盐处理方法及单链DNA的制备和制备试剂盒。

本发明提供一种DNA产物的脱盐处理方法，包括：将琼脂糖、葡萄糖和无菌水混合加热熔融，然后冷却形成凝胶，并使得所述的凝胶上形成有可放入液体的空间，将DNA产物置于所述空间，冰上处理60-120min。

进一步地，加热熔融后，所述琼脂糖的浓度为6-16g/mL，葡萄糖的浓度为12-24g/mL。

进一步地，所述DNA产物为PCR产物、酶切产物或质粒DNA等。

本发明还提供一种单链DNA的制备方法，包括如下步骤：

将目标DNA克隆到载体中，形成重组载体，所述目标DNA位于限制性内切酶和/或切刻内切酶酶切位点之间；

使用相应的限制性内切酶和/或切刻内切酶消化所述重组载体；