[发明专利]一种重组基因工程菌及其发酵产香兰素的应用

说明书

本发明公开了一种重组基因工程菌及其发酵产香兰素的应用，所述重组基因工程菌是由耐受香兰素或阿魏酸的基因导入宿主菌构建而成，所述耐受香兰素或阿魏酸的基因包括周质膜融合蛋白AcrA基因、内膜转运蛋白AcrB基因或外膜蛋白TolC基因中的一种或多种；所述宿主包括含ech基因和fcs基因的大肠杆菌。本发明所述重组基因工程菌E.coli BW25113::PegYB::pACYCDuet‑acrAB‑tolC可利用阿魏酸为底物生产香兰素，香兰素最高产量为2335mg/L。采用本发明的方法发酵产生的发酵液中含有更高的香兰素，具有很好的应用前景。

(一)技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一种重组工程菌及其生产香兰素的方法，尤其是一种耐受阿魏酸和香兰素的重组工程菌及其构建方法，以及利用该菌株以阿魏酸为底物生产香兰素的方法。

(二)背景技术

香兰素(Vanillin)，又名香草醛，化学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，是人们普遍喜爱的奶油香草香精的主要成分。香兰素是目前全球用量最大的香料，消费者尤其欢迎利用生物技术获得的天然香兰素。从植物中提取的天然香兰素产量少、价格贵，利用微生物发酵是生产天然香兰素的一种重要方法。

近年来，一些研究者尝试利用重组大肠杆菌转化阿魏酸生产天然香兰素，并且取得了一定的进展，但距离工业化生产仍面临一些需要解决的问题。如：阿魏酸和香兰素都对大肠杆菌具有毒害作用，高浓度条件下会抑制菌株的生长和代谢，并导致细胞自溶。虽然Lee等人在发酵液中添加XAD-2树脂可以提高香兰素的产量，但树脂容易破碎并不适合工业化生产的要求。因此，提高重组菌对阿魏酸和香兰素的耐受性是现阶段生产天然香兰素研究的瓶颈，亟待突破。

外排泵是一种存在于细菌细胞内膜并依赖消耗能量的外排作用系统，通过主动运输，将对细胞有害的物质从胞内排出，使胞内有害物质浓度降低，减缓有害物质对细胞生长和代谢的抑制作用。在大肠杆菌中，AcrAB-TolC外排泵由跨越细胞膜的多种蛋白质组成，包括外膜蛋白TolC，周质膜融合蛋白AcrA和内膜转运蛋白AcrB。该外排泵能将多种药物主动排出细胞，从而使细菌对多种抗生素具有耐药性。目前，尚无AcrAB-TolC外排泵与大肠杆菌耐受阿魏酸和香兰素的相关报道；也无利用过表达AcrAB-TolC外排泵相关基因，提高重组大肠杆菌制备香兰素的生产效率的相关报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种耐受高浓度阿魏酸和香兰素的重组工程菌，在以阿魏酸为底物发酵生产香兰素的过程中提高细胞的浓度，从而获得更高产量的香兰素。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌是由耐受香兰素或阿魏酸的基因导入宿主菌构建而成，所述耐受香兰素或阿魏酸的基因包括周质膜融合蛋白AcrA基因、内膜转运蛋白AcrB基因或外膜蛋白TolC基因中的一种或多种；所述宿主包括含ech基因(GeneBank序列号KC847406.1)和fcs基因(GeneBank序列号KC847405.1)的大肠杆菌。

进一步，所述耐受香兰素或阿魏酸的基因源自大肠杆菌，所述周质膜融合蛋白AcrA基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1(1-1394)所示(编码酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2(1-397)所示)、内膜转运蛋白AcrB基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1(1395-4744)所示(编码酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2(398-1446)所示)或外膜蛋白TolC基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1(4745-6426)所示(编码酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2(1447-1939)所示)。

进一步，优选所述耐受香兰素或阿魏酸的基因由周质膜融合蛋白AcrA基因、内膜转运蛋白AcrB基因和外膜蛋白TolC基因组成，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示、编码酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。