[发明专利]一种获取雪线酵母菌的方法

权利要求书

1.一种获取雪线酵母菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、收集菌源，采用无菌的采集箱采取高山雪线附近土壤表层下1-10cm的土壤，将土壤装入灭菌的牛皮纸袋内，在冷冻、干燥的条件下保存；

S2、分离，首先制备菌悬液，将菌源加入到盛有无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，振荡20min，制成10^-2的菌源悬液，采用无菌水或无菌生理盐水将10^-2的菌源悬液进一步的稀释成10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的菌源悬液；

然后分离，在培养皿中倾注10-15ml的豆芽汁葡萄糖培养基，采用无菌移液管吸取0.08-0.12ml的菌源悬液滴入豆芽汁葡萄糖培养基平板上，每个稀释度做2-3个平行皿，在火焰旁使用无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散；

S3、培养，将接种后的豆芽汁葡萄糖培养基平板倒置于28-32℃的恒温箱中，培养2-4天；

S4、纯化，用接种环挑取单个酵母菌菌落，在豆芽汁葡萄糖培养基平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落，将菌种放入冷冻管中进行冷冻保存；

S5、活化，将冷冻管中豆芽汁葡萄糖培养基在室温下达到室温后，振动均匀，转入含有豆芽汁葡萄糖培养基的试管中在25±1℃的温度下进行2-3代的培养复壮；

S6、扩大，将活化后的试管内的豆芽汁葡萄糖培养基轻轻振荡均匀，全部接入加有豆芽汁葡萄糖培养基的巴氏瓶或卡氏罐中培养扩大；

S7、菌种保藏，菌种以固体斜面形式在0-4℃温度下冷藏保藏，每三个月进行活化一次。

2.根据权利要求1所述的一种获取雪线酵母菌的方法，其特征在于：所述豆芽汁葡萄糖培养基的温度为45-55℃。

3.根据权利要求1所述的一种获取雪线酵母菌的方法，其特征在于：所述步骤S2中的分离过程在无菌室内的超净工作台上进行，无菌室使用前使用紫外线灯照射20-30分钟进行杀菌。

4.根据权利要求1所述的一种获取雪线酵母菌的方法，其特征在于：所述S5中培养复壮过程包括以下步骤，

S51、采用无菌操作，将冷冻管内的豆芽汁葡萄糖培养基全部转入盛有5ml的豆芽汁葡萄糖培养基的试管中，在25±1℃温度下培养72±2小时；

S52、将S51中培养结束的试管中的豆芽汁葡萄糖培养基轻轻振荡均匀，用接种环接取三环加入另一支盛有5ml豆芽汁葡萄糖培养基的试管中，在25±1℃温度下培养24-36小时；

S53、将S52中培养结束的试管中的豆芽汁葡萄糖培养基轻轻振荡均匀，用无菌吸管吸取0.08-0.12ml的S52培养结束振荡均匀的豆芽汁葡萄糖培养基加入盛有10ml豆芽汁葡萄糖培养基的试管，振荡均匀后在25±1℃温度下培养24-36小时。

5.根据权利要求1所述的一种获取雪线酵母菌的方法，其特征在于：所述S6中扩大过程包括以下步骤：

S61、将活化后的菌种全部接入50ml-100ml的小巴氏瓶，小巴氏瓶中加入10ml的豆芽汁葡萄糖培养基，在23±1℃的温度下培养24-36小时；

S62、将培养结束后的小巴氏瓶轻轻振荡均匀后，全部接入250ml-500ml的大巴氏瓶，每个大巴氏瓶接入一只小巴氏瓶的培养液，然后在21±1℃的温度下培养24-36小时；

S63、将培养结束的大巴氏瓶轻轻振荡均匀后，全部接入10-20L的卡氏罐中，每个卡氏罐接入两只大巴氏瓶的培养液；然后在18±1℃温度下培养24-36小时。

6.根据权利要求5所述的一种获取雪线酵母菌的方法，其特征在于：所述小巴氏瓶及大巴氏瓶中培养基在接种后每12小时振摇一次。

7.根据权利要求1所述的一种获取雪线酵母菌的方法，其特征在于：所述S7中活化过程包括以下步骤：

接一环斜面菌种于5ml麦芽汁培养基中，在25±1℃温度下培养24-36小时；待菌种起发后，将培养液振荡均匀，用接种环涂划平板斜面，在25±1℃温度下培养60-72小时，然后于0-4℃冷藏保藏。