[发明专利]可控自催化切割介导荧光恢复检测hAAG的传感器及方法

权利要求书

1.一种基于可控自催化切割介导的荧光恢复检测hAAG的传感器，其特征是，包括发夹探针1、发夹探针2、信号探针、人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶和T7核酸外切酶；

发夹探针1为5'-OH末端凸出的茎环结构的DNA，发夹探针1的5'-OH末端的茎修饰一个能够被hAAG识别的2'-脱氧肌苷，2'-脱氧肌苷位于距离环3个碱基的位点处，发夹探针1含有触发探针1，触发探针1为2'-脱氧肌苷至3'末端的DNA序列，触发探针1含有能够和发夹探针2的第二DNA序列互补的第一DNA序列，第一DNA序列为2'-脱氧肌苷和与2'-脱氧肌苷配对的碱基位点之间的DNA序列；

发夹探针2为5'-OH末端凸出的茎环结构的DNA，发夹探针2由触发探针2和第二DNA序列组成，第二DNA序列为5'-OH末端凸出的DNA序列，触发探针2含有能够与信号探针互补的第三DNA序列，第三DNA序列的一部分位于茎上，第三DNA序列的另一部分位于环上；

信号探针为单链DNA，信号探针两端分别修饰荧光团和淬灭剂；

所述荧光团和淬灭剂分别修饰在信号探针的5'末端和3'末端；

所述荧光团为FAM，所述淬灭剂为BHQ1；

发夹探针1的序列为：5'-GTA GTG AGG TAG GTT GTA TIG TTG GGT TGA ACT ATA CAACCT ACC-3'；

发夹探针2的序列为：5'-TGT ATA GTT CAA CCC GGG ACC TAA GAG CAT TCT ACA CCTCTT AGG TCC CTG C-3'；

信号探针的序列为：5'-AAG AGG TGT A-3'。

2.一种基于可控自催化切割介导的荧光恢复检测hAAG的传感器在制备检测hAAG试剂盒中的应用，其特征是，提供权利要求1所述的传感器；当hAAG存在时，hAAG与APE1在发夹探针1的2'-脱氧肌苷位点处特异性识别并切割发夹探针1，使得发夹探针1展开发夹结构，产生具有凸出的5'-OH和5'-dRP末端的dsDNA双链体I，dsDNA双链体I中突出的5'-dRP末端通过粘性末端介导的链置换反应，使触发探针1的第一DNA序列与发夹探针2的第二DNA序列杂交，形成具有凹陷的5'-OH末端的dsDNA双链体II，dsDNA双链体II作为T7核酸外切酶的底物，在T7核酸外切酶的作用下，使发夹探针2中凹陷的5'-OH末端特异性水解，释放触发探针1并同时释放出发夹探针2中的触发探针2，释放的触发探针1与过量的发夹探针2杂交，诱导T7核酸外切酶催化发夹探针HP2的第一次循环切割以释放多个触发探针2，触发探针2的第三DNA序列与信号探针杂交，形成具有凹陷的5'-OH末端的dsDNA双链体III，dsDNA双链体III作为T7核酸外切酶的底物，从凹陷的5'-OH末端对信号探针进行连续消化，从而释放触发探针2和荧光团，释放的触发探针2与游离的信号探针杂交以诱导T7核酸外切酶催化第二次循环切割信号探针，从而释放出大量的荧光团，产生放大的荧光信号。

3.如权利要求2所述的应用，其特征是，步骤为：

(1)将发夹探针1加入至含有hAAG、10×ThermoPol反应缓冲液、APE1、10×NEBuffer4的第一溶液中加热孵育；

(2)将步骤(1)的物料添加至含有发夹探针2、信号探针、T7核酸外切酶、10×NEBuffer4的第二溶液中进行孵育；

(3)对步骤(2)孵育后的物料进行荧光检测。

4.如权利要求3所述的应用，其特征是，步骤(1)中孵育条件：温度为37±0.5℃，时间为60～90min；

或，步骤(1)的第一溶液中，APE1的浓度为0.3个单位每微升；每20微升第一溶液含有2微升10×ThermoPol反应缓冲液、2微升10×NEBuffer 4；

或，步骤(1)中，发夹探针1的溶液与第一溶液的体积比为1:9.5～10.5，发夹探针1的溶液中发夹探针1的浓度为1微摩尔每升。