[发明专利]一种菌群绝对定量方法及在中国白酒发酵过程中的应用

说明书

本发明公开了一种菌群绝对定量方法及在中国白酒发酵过程中的应用，属于生物领域和发酵工程领域。本发明首次构建一种基于天然内标计算微生物菌群绝对含量的方法。本发明所提供的天然内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的特异性引物可以在白酒发酵系统中检测和定量内标。进一步地，本发明针对内标的分布范围进行统计，结果显示内标广泛分布在清香型、酱香型、浓香型、豉香型、芝麻香型白酒发酵系统中。通过对内标的绝对定量，能够对不同香型的菌群含量进行计算，具有操作方便、应用范围广的特点。

技术领域

本发明涉及一种菌群绝对定量方法及在中国白酒发酵过程中的应用，属于生物领域和发酵工程领域。

背景技术

中国白酒具有几千年的发展历史，是中国宝贵的文化财富。中国白酒属于固态多菌种混合发酵系统，其中细菌群落在发酵过程中扮演着重要的角色，如芽胞杆菌、乳酸菌、乳球菌等。细菌菌群绝对定量是研究菌群功能的基础，过去研究中使用高通量扩增子测序技术有效地揭示了白酒发酵过程中细菌群落的组成和结构，但是由于只能使用相对丰度来定量细菌群落，不能真实反应菌群在时间和空间上的动态变化特征，所以建立绝对定量细菌菌群方法是白酒微生物研究的方向。除了白酒以外，其他发酵物中也存在类似的问题。

最新的研究中，通过人为添加内标片段的方式，结合高通量扩增子测序技术构建细菌菌群绝对定量方法。这种方法是将原始体系不存在的菌种，或带有随机产生的16SrRNA片段或带有16S rRNA片段质粒作为内标，人为添加到原始体系中，通过计算内标在高通量测序结果中所占比例与所添加内标的绝对含量之间的对应关系，推算整个细菌菌群或某一特定分类的绝对含量。但是寻找原始体系中绝对不存在的菌种存在困难，较难实现；通过添加内标的方法不仅操作不便，而且会对原始的菌群结构测序结果产生干扰。

发明内容

本发明提出的采用天然内标方法对菌群定量的方法，能够有效解决背景技术中的至少一个问题。同时，本发明通过筛选系统中的天然内标，构建菌群绝对定量方法在白酒酿造体系具有重要的研究和使用价值，该技术方法为其它发酵食品体系中微生物菌群绝对定量提供借鉴。

本发明的采用天然内标方法对发酵物的菌群进行定量的方法，包括：

(1)获取两个以上发酵物样品中的菌群的种属情况，然后选择在该两个以上发酵物样品中都存在的菌种作为天然内标；

(2)对待测发酵物样本中的天然内标进行绝对定量；

(3)确定待测发酵物样本中，需要绝对定量的待测菌群与天然内标的相对含量；

(4)根据(1)和(2)，换算得到待测发酵物样本中待测菌群的绝对含量。

所述发酵物，可以是任意一种微生物种类在两种以上的发酵物。

所述发酵物，可以是食醋、酱油、奶酪、虾酱、泡菜、香肠、白酒发酵体系中的发酵物。

在一种实施方式中，所述(2)中，对待测样本中的内标进行绝对定量，可通过荧光定量PCR(qPCR)来实现。可选地，所述荧光定量PCR所用的引物为内标的特异性引物。

在一种实施方式中，所述(3)中，确定待测菌群与内标的相对含量，可以通过现有的扩增子测序来实现。可选地，扩增子测序结果中的相对含量是利用通用细菌测序引物基于任何测序平台测序所得。