[发明专利]一种用于辅助诊断结核性胸膜炎的实时荧光定量PCR试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于辅助诊断结核性胸膜炎的实时荧光定量PCR试剂盒及其应用。所述的试剂盒中含有用检测结核杆菌特异性小RNA片段(包括Mtb‑ms‑1和Mtb‑ms‑2)的引物和探针，其中Mtb‑ms‑1的序列如SEQ ID NO.1所示，Mtb‑ms‑2的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过提取胸膜炎患者少量胸水的总RNA，将其中结核杆菌特异性小RNA片段逆转录为互补的cDNA，应用特异引物探针进行实时荧光定量聚合酶链反应检测，其诊断的敏感性、特异性均较高，能够显著地区分结核性胸膜炎和对照组，优于结核杆菌培养、抗酸涂片染色、DNA检测等诊断方法。

技术领域

本发明涉及一种基于实时荧光定量聚合酶链反应法检测结核性胸膜炎患者胸水中结核杆菌编码的特异性小RNA片段的试剂盒，并应用于结核性胸膜炎的辅助诊断。本发明属于医药技术领域。

背景技术

结核病是世界范围内发病率最高、影响最大的感染性疾病之一，其中约1/4为肺外结核。结核性胸膜炎是发病率第二的肺外结核，仅次于淋巴结核，是渗出性胸膜炎的最常见病因。结核性胸膜炎的传统确诊手段包括结核杆菌培养、抗酸涂片染色、胸膜活检等，诊断的敏感性低，消耗时间长，常导致治疗时机的延误。近年来，针对结核杆菌核酸的分子检测技术，尤其是结核杆菌DNA的聚合酶链反应(PCR)检测，能够在耐热DNA聚合酶作用下直接扩增结核杆菌特异的基因片段，具有较高的诊断特异性和敏感性。然而，大型meta分析表明，MTB/RIF聚合酶链反应法等结核杆菌核酸检测在结核性胸膜炎中阳性率较低(22.7％～51.4％)，这是因为结核性胸膜炎属于少菌性感染(paucibacillaryinfection)，胸水中结核杆菌数量少。而且，MTB/RIF技术由于价格昂贵等原因，在世界范围很多地区难以得到推广。

研究显示，针对非编码性小RNA(non-coding small RNA)的检测，包括真核生物的microRNA等，是疾病的优秀生物标志物，其检测敏感性、特异性相当高。近年研究证明，细菌能够编码特异性的、长约20-30个核苷酸的小RNA片段，在体内表达、分泌，并具有生物学功能，具有作为感染性疾病诊断标志物的潜力。然而目前，胸水中结核杆菌编码的特异性小RNA的检测及其用于辅助结核性胸膜炎诊断的应用尚未见报道。

发明内容

本发明克服了结核性胸膜炎现有实验室诊断方法诊断敏感性低、耗时长、成本高的缺陷，提供了一种敏感、特异、快速的分子生物学检测方法，其诊断结核性胸膜炎的敏感性优于传统的结核杆菌检测和结核杆菌DNA检测等方法，因此能够作为结核性胸膜炎的新的诊断方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

一方面，本发明提出了一种作为辅助诊断结核性胸膜炎的生物标志物，所述的生物标志物为结核杆菌特异性小RNA片段，包括Mtb-ms-1和Mtb-ms-2，其中Mtb-ms-1的序列如SEQ ID NO.1所示，Mtb-ms-2的序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，本发明还提出了所述的生物标志物在制备辅助诊断结核性胸膜炎的试剂中的应用。

另一方面，本发明提出了一种用于检测所述的生物标志物的引物对和探针组合，其中，优选的，用于检测Mtb-ms-1的引物对序列如SEQ ID NO.3和4所示，探针序列如SEQ IDNO.5所示；用于检测Mtb-ms-2的引物对序列如SEQ ID NO.6和7所示，探针序列如SEQ IDNO.8所示。

进一步的，本发明还提出了所述的引物对和探针组合在制备辅助诊断结核性胸膜炎的试剂中的应用。

再一方面，本发明提出了一种用于辅助诊断结核性胸膜炎的实时荧光定量PCR试剂盒，所述的试剂盒中含有用于检测所述的生物标志物的引物对和探针组合，所述的生物标志物为结核杆菌特异性小RNA片段，包括Mtb-ms-1和Mtb-ms-2，其中，Mtb-ms-1的序列如SEQ ID NO.1所示，Mtb-ms-2的序列如SEQ ID NO.2所示。