[发明专利]一种重组猪流行性腹泻病毒N、S蛋白单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明涉及一种重组猪流行性腹泻病毒N、S蛋白单克隆抗体的制备方法，首先设计特异性的引物，得到重组表达载体PcoldI‑N、PcoldI‑S，转入大肠杆菌Rosseta后，经IPTG诱导获得重组蛋白；利用亲和柱对重组蛋白进行纯化；以纯化的重组蛋白作为免疫原，取6‑8周龄Balb/c雌性小鼠，按照免疫程序进行免疫，取免疫小鼠脾细胞与S/P20细胞融合，利用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选出阳性杂交瘤细胞株；将筛选出的阳性杂交瘤细胞株经过三次亚克隆，得到3株抗PEDV N蛋白特异性杂交瘤细胞株；将3株抗PEDV N蛋白特异性杂交瘤细胞株分别注入小鼠腹腔，收获腹水并进行纯化，最终获得了具有高纯度高特异性的抗PEDV单克隆抗体。通过本发明，能够获得了具有高纯度高特异性的抗PEDV单克隆抗体。

技术领域

本发明涉及一种重组猪流行性腹泻病毒N、S蛋白单克隆抗体的制备方法，涉及猪流行性病毒的N、S基因，属于分子生物学领域，同时也涉及抗PEDV单克隆抗体一种新的快速高效检测PEDV的抗体生产技术领域。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起猪的一种急性高度接触性传染病，主要以腹泻、呕吐和脱水为特征，该病分布广，危害严重，给养猪业带来重大经济损失。PED与猪传染性胃肠炎(Porcine TransmissibleGastroenteritis，TGE)非常相似，在临床表现等各个方面都不易区分，所以给该病及时诊断和治疗带来了一定困难。近年来，随着我国规模化猪场比例的不断扩大，种猪场的不断增加，仔猪病死率升高，本病的危害也愈加突出，给我国养猪业带来巨大打击。

N蛋白作为核衣壳蛋白是冠状病毒结构蛋白中的多功能磷酸化蛋白质，保守型强，且在病毒粒子中含量高，在感染的细胞中能够大量表达，同时N蛋白在病毒的复制和机体免疫方面发挥重要作用。猪在感染PEDV早期，体内会产生较高水平的抗N蛋白抗体，所以利用N蛋白建立的检测PEDV诊断技术具有很好的前景。S蛋白为纤突蛋白，位于病毒囊膜表面，该蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要结构蛋白，具有很强的免疫原性。感染PEDV的猪的血清中抗S蛋白抗体较持久，可长时间的检测到S蛋白抗体。

单抗涉及多种检测方法，包括补体结合试验、血清中和试验、免疫荧光技术、免疫酶技术等，这些技术都已经在临床或实验室得到广泛应用。单克隆抗体在疾病诊断和治疗等方面广泛应用，近年来，不少学者研制出了很多单克隆抗体，其中很多单抗对于改善临床疾病诊断的方法至关重要，单克隆抗体可以用来建立快速的临床检查方法。综上所述，单克隆抗体对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。

发明内容

本发明目的是提供一种重组猪流行性腹泻病毒N、S蛋白单克隆抗体的制备方法，制备出抗PEDV的单克隆抗体。

本发明的目的是这样实现的，一种重组猪流行性腹泻病毒N、S蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)根据GenBank中已发表的猪流行性腹泻病毒N、S基因序列设计特异性的引物(上下游分别插入相应的酶切位点)，通过PT-PCR方法扩增N、S基因，测序鉴定正确后克隆到原核表达载体PcoldI上，得到重组表达载体PcoldI-N、PcoldI-S；

(2)将步骤(1)得到的重组表达载体PcoldI-N、PcoldI-S转入大肠杆菌Rosseta后，经IPTG诱导获得重组蛋白；

(3)利用亲和柱对重组蛋白进行纯化，并用Western-Blot鉴定分析所获得的重组蛋白，结果表明表达的重组蛋白具有反应原性；

(4)以纯化的重组蛋白作为免疫原，取6-8周龄Balb/c雌性小鼠，按照免疫程序进行免疫，取免疫小鼠脾细胞与S/P20细胞融合，利用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选出阳性杂交瘤细胞株，同时用重组蛋白包被酶标板，建立了间接ELISA检测单抗的方法；