[发明专利]Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用

说明书

本发明公开了Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用。本发明公开的Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法包括向受体细胞中导入sgRNA和Cas9蛋白质，实现VPS28基因的突变，sgRNA为sgRNA1或/和sgRNA2，sgRNA1的靶序列为序列表中序列1的第1313‑1332位，sgRNA2的靶序列为序列表中序列1的第3118‑3137位。本发明的Vps28基因突变的方法和动物模型，为研究Vsp28基因在乳腺组织发育、泌乳以及其它生理生化代谢过程中的作用提供了便捷、可靠、经济的动物模型。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用。

背景技术

Vps28(Vacuolar protein sorting 28,Vps28)是编码液泡蛋白分选蛋白的基因，该蛋白是转运必需内吞体分选复合体ESCRT-Ⅰ(Endosomal Sorting Complex Requiredfor TransportⅠ)的重要组成成分。ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ共同组成ESCRT复合体。ESCRT复合体是一种内体蛋白分选转运装置，主要识别泛素化修饰的膜蛋白，在分选和降解泛素化的膜蛋白过程中发挥重要作用。此外，ESCRT参与多种细胞代谢过程，包括多泡体的形成、细胞脱落、自体吞噬和包膜病毒出芽等。有研究表明，如果ESCRT复合体组件受损，将导致各种不同疾病的发生，如白化病、神经变性病、肿瘤等。复合体中的组件中的ESCRT-Ⅰ包含泛素结合位点，通过聚集泛素化蛋白产生多泡体，并且是ESCRT-0和ESCRT-Ⅲ的桥梁。ESCRT-Ⅰ由Vps23，Vps28，Vps37和Mvb12组成。Vps28是ESCRT-Ⅰ的顶端帽子结构，与ESCRT-Ⅱ中的Vps36结合。Vps36同时与泛素蛋白结合。因此，Vps28可以通过影响内体ESCRT装置的稳定性而影响该装置对泛素化蛋白的识别、分选和转运。

Vps28位于奶牛的14号染色体，全长4978bp，编码221个氨基酸。小鼠的Vps28基因位于15号染色体，全长3999bp，编码221个氨基酸，与奶牛的蛋白序列同源性可达到99％。该蛋白在不同物种间高度保守。奶牛产奶性状全基因组关联分析(Genome-wide AssociationStudy，GWAS)研究发现Vps28与奶牛的产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白率显著相关(P<0.01)。随后，申请人利用目标区域捕获测序技术对Vps28基因5’UTR区的一个SNP位点在新的奶牛资源群体中进行产奶性状关联分析，结果显示该位点与产奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率和乳蛋白率都显著相关，所有性状中最大P值为1.99E-09。利用qPCR技术对奶牛泌乳期的8个不同组织(心、肝、肺、肾、乳腺、卵巢、子宫、肌肉)进行Vps28基因表达量的检测，发现其在乳腺组织中呈现特异性高表达。在此基础上，申请人进一步在奶牛乳腺上皮细胞中对Vps28进行了基因干扰实验，结果显示在Vps28表达水平下调后，奶牛乳腺上皮细胞中脂肪酸转运蛋白CD36、脂肪分化相关蛋白ADFP及甘油三酯的表达水平均显著上升(P<0.05)。电子显微镜观察发现，与对照组相比，Vps28干扰组的乳腺上皮细胞中存在数量更多体积更大的脂肪滴，增加乳脂的合成。上述研究结果说明Vps28基因对奶牛的产奶性状表型发挥了重要作用，与奶牛的泌乳过程密切相关，是产奶性状的重要候选功能基因。

目前，进行基因功能研究最直接有效的方法是构建转基因和(或)基因敲除动物模型。CRISPR/Cas9技术通过导向RNA(sgRNA)介导核酸内切酶Cas9蛋白进行靶向DNA序列识别并造成DNA双链断裂，以同源重组或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而实现对目标位点实现基因的定点敲除、敲入等多种修饰。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何突变动物中的VPS28基因以及如何制备VPS28基因发生突变的动物模型。