[发明专利]用于预防弓形虫感染的RH:Δtkl1减毒活疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于预防弓形虫感染的RH:Δtkl1减毒活疫苗，该减毒活疫苗的制备方法是构建质粒pSAG1::Cas9::U6sgTKL1和DHFR抗性片段，然后构建弓形虫RH:Δtkl1虫株，以PBS作为溶剂在细胞培养基中制成弓形虫弱毒虫株RH:Δtkl1的速殖子混悬液。本发明确立了该减毒活疫苗的免疫剂型，探明了其免疫接种程序及剂量，通过动物实验发现本发明制备的减毒活疫苗对于弓形虫急性感染、慢性感染及先天性感染均具有良好的免疫保护作用，可有效预防弓形虫病。

技术领域

本发明属于弓形虫减毒活疫苗技术领域，尤其涉及一种用于预防弓形虫感染的RH:Δtkl1减毒活疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)简称弓形虫，是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫，可感染包括人在内的几乎所有的温血动物，在世界范围内广泛分布。免疫缺损者感染弓形虫后可引起宿主严重的脑病、眼病、流产、畸胎或死胎等，严重危害人类的健康，并给畜牧业造成巨大的经济损失。

研究表明，弓形虫在中间宿主体内存在速殖子和缓殖子2种形态，而现有药物的治疗仅对虫体的速殖子时期起作用，对于包囊内的缓殖子收效甚微，且药物的使用存在一定的毒副作用。于是，对于弓形虫病的防控转向疫苗免疫宿主的开发研究，但因靶标基因寻找困难，目前为止尚无有效疫苗可用于弓形虫病的防控。

目前研发较为集中的灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗等弓形虫病疫苗，其对免疫机体仅能提供部分免疫保护力，不能完全保护，免疫保护效果并不理想。因此，弓形虫病疫苗的研发转向了免疫原性好、免疫期长的弱毒疫苗。而目前仅有一株S48弓形虫弱毒活疫苗被允许在预防山羊和绵羊的流产中应用，因此研究出更多的弓形虫弱毒疫苗以扩大其应用范围是目前弓形虫病疫苗研究的重要目标。

发明内容

针对上述背景技术中指出的现有技术的不足，本发明提供了一种用于预防弓形虫感染的RH:Δtkl1减毒活疫苗及其制备方法，所制备的减毒活疫苗能够有效抵抗弓形虫的急性感染、慢性感染和先天性感染，可用于预防弓形虫病。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于预防弓形虫感染的RH:Δtkl1减毒活疫苗，该减毒活疫苗是以PBS作为溶剂制成的弓形虫弱毒虫株RH:Δtkl1的速殖子混悬液。

上述用于预防弓形虫感染的RH:Δtkl1减毒活疫苗的制备方法如下：

(1)敲除质粒的构建

根据弓形虫TKL1基因设计sgRNA：GCCTCAGACTGCCAAAGGGA，然后将pSAG1::Cas9::U6sgUPRT中的sgRNA替换成TKL1，即构建质粒pSAG1::Cas9::U6sgTKL1；从质粒pUPRT-DHFR-D扩增获得DHFR抗性片段；

(2)弓形虫虫株RH:Δtkl1的构建

培养速殖子用于弓形虫的电转染，将所述质粒pSAG1::Cas9::U6sgTKL1与DHFR抗性片段电转到弓形虫中，获得弓形虫单克隆虫株，放大培养后，提取基因组DNA，验证TKL1基因是否敲掉，PCR扩不出来者为阳性RH:Δtkl1虫株；

(3)减毒活疫苗的制备

含FBS的DMEM培养基中加入100μL RH:Δtkl1虫株，培养并收集RH:Δtkl1速殖子，过滤细胞碎片，然后用无菌PBS调整速殖子的浓度。

优选地，所述DHFR抗性片段扩增的引物为：

DHFR-F：AAGCTTCGCCAGGCTGTAAA；

DHFR-R：GGAATTCATCCTGCAAGTGC。

优选地，验证TKL1基因是否敲掉时，所用引物为：