[发明专利]一种血浆cfDNA全局性甲基化检测方法及应用

权利要求书

1.一种血浆cfDNA全局性甲基化检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、从血浆中提取出cfDNA；

步骤2、在所述步骤1中得到的所述cfDNA中补加甲基化且含有生物素标记的λDNA；

步骤3、进行富集甲基化实验，并将收集的产物通过PCR扩增后，基于生物素-链霉亲和素反应、采用链霉亲和素磁珠去除所述产物中带有生物素标记的λDNA，得到cfDNA扩增文库；

步骤4、将所述步骤3得到的所述cfDNA扩增文库进行高通量测序。

2.如权利要求1所述的血浆cfDNA全局性甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤1和步骤2之间还需进行cfDNA原始文库的构建，包括以下步骤：

S1、将cfDNA进行末端修复；

S2、在cfDNA 3’末端添加A碱基；

S3、将经过所述S1、S2步骤处理的cfDNA两端连接测序接头引物，得到连接产物；

S4、将所述S3中得到的所述连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离并回收200-500bp范围内的所述连接产物，得到纯化的cfDNA原始文库。

3.如权利要求2所述的血浆cfDNA全局性甲基化检测方法，其特征在于，所述测序接头引物为P5和P7，其中所述P5的DNA序列为AATGATACGGCGACCACCGAG，所述P7的DNA序列为CAAGCAGAAGACGGCATACGAG。

4.如权利要求1所述的血浆cfDNA全局性甲基化检测方法，其特征在于，所述λDNA的制备包括以下步骤：

T1、设计一对含生物素标记的引物Bio-λDNA-F和Bio-λDNA-R；

T2、通过PCR扩增制备含生物素标记的Bio-λDNA，并对产物进行胶回收纯化；

T3、取部分所述T2得到的Bio-λDNA进行体外甲基化处理。

5.如权利要求1所述的血浆cfDNA全局性甲基化检测方法，其特征在于，所述λDNA在补加入所述cfDNA中时，除甲基化的Bio-λDNA以外，还需加入未甲基化的Bio-λDNA，其中所述甲基化的Bio-λDNA不低于50ng。

6.如权利要求1所述的血浆cfDNA全局性甲基化检测方法，其特征在于，所述cfDNA的扩增文库还需要进行胶回收纯化，筛选200-500bp的DNA片段。

7.如权利要求1所述的血浆cfDNA全局性甲基化检测方法，其特征在于，所述富集甲基化实验，可选择MeDIP-seq(Methylated DNA immunoprecipitation sequencing)、MethylCap(Methylated DNA affinity capture)或MBD(Methylated DNA bindingdomain)任一种方法实现。

8.一种用于血浆cfDNA全局性甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述血浆cfDNA全局性甲基化检测的试剂盒采用如权利要求1-7任意一项所述的血浆cfDNA全局性甲基化检测方法，包括生物素标记试剂、PCR扩增通用试剂、DNA甲基化处理试剂、测序接头引物、接头连接试剂、富集甲基化后扩增引物、链霉亲和素磁珠。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述测序接头引物和所述富集甲基化后扩增引物均为P5和P7，其中所述P5的DNA序列为AATGATACGGCGACCACCGAG，所述P7的DNA序列为CAAGCAGAAGACGGCATACGAG。

10.一种如权利要求8或9所述的试剂盒在血浆cfDNA全局性甲基化检测中的应用。