[发明专利]一种鉴别冬虫夏草真伪的引物对、试剂盒、方法及其用途

说明书

本发明属于中药材鉴别领域，涉及一种鉴别冬虫夏草真伪的引物对、试剂盒、方法及其用途。具体地，本发明涉及一种鉴别冬虫夏草真伪的引物对：CC‑2F：5′‑ATTAAGTCGTGGAAATG‑3′，CC‑2R：5′‑GATCAGGAATAGTGGGA‑3′，其试剂盒，及其使用该引物对通过PCR扩增进行冬虫夏草真伪鉴别的方法。该方法特异性强，检测范围更加广泛。本发明还涉及使用二重引物对CC‑2F/CC‑2R和DCF4/DCR4通过PCR扩增进行冬虫夏草真伪鉴别的方法，该方法扩增效果更明显、鉴别方法稳定可靠，鉴别范围广泛。

技术领域

本发明属于中药材鉴别领域，具体涉及一种鉴别冬虫夏草真伪的COI特异性引物对、包含其的试剂盒、鉴别冬虫夏草真伪的PCR方法及其在鉴别冬虫夏草真伪中的用途。

背景技术

冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis sym.Cordyceps)为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾幼虫上的子座(子实体)及幼虫尸体的复合体，主要分布于青藏高原3000以上的雪线以上的地区。早在《本草备要》中记载：“冬虫夏草，甘平，保肺益肾，止血化痰，止劳咳。”近几十年来，由于产区雪线上移和人们过度采挖，造成了冬虫夏草资源稀缺，逐年递减，市场供不应求，使其价格十分昂贵。在利益的驱使下，不法商贩采取掺假、造假的手段牟利，从而使市场上出现了各种各种的伪品，常见的伪品有新疆虫草、亚香棒虫草、地蚕、虫草菌丝体、蝉花等，部分伪品的外观与冬虫夏草比较相似，且粉粹后与冬虫夏草粉极为相似。这些伪品药用价值和营养价值与冬虫夏草相差甚远，对其用药安全造成极大的威胁。由此可见，作为中华医宝的魁宝之一的冬虫夏草，对其身份的真实性鉴别显得非常重要。

近年来，随着中药鉴定学的发展，中药鉴定的新技术和新方法不断被应用，其中分子生物学的引入，使得可以从基因层面解决中药品种混乱的问题。目前，冬虫夏草真伪鉴别较多采用基源(外观、性状、显微)以及理化鉴别等传统方法，而分子生物学方法应用较少。文献《冬虫夏草的分子鉴定方法》(华西药学杂志，2017,32(20):205-207)、《冬虫夏草特异性PCR鉴定方法研究》(中国医学科学，2015，5(9):55-57)、《基于PCR的冬虫夏草检测方法研究》(中药材，2018,41(3):554-558))是基于ITS区设计了冬虫夏草特异性引物，然后通过PCR鉴别冬虫夏草真伪；申请号为CN201810150240.8、发明名称为“一种冬虫夏草的真伪鉴别方法”是基于COI区设计了冬虫夏草特异性并用于冬虫夏草真伪鉴别。而现有的这些文献所鉴别的冬虫夏草伪品数量较少。

另外，冬虫夏草作为一种虫菌复合体，根据所处的不同阶段，分为有性型(子囊孢子阶段)和无性型(分生孢子阶段)。日常我们所指的冬虫夏草是指有性型，即由冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾成功后形成的冬虫夏草虫菌复合体。同一种真菌寄生在不同寄主上，或者不同真菌寄生在同一寄主上，产生的外形相似的复合体都有可能成为冬虫夏草正品的伪品或混淆品，如白僵菌、云南无钩蝠蛾等作为菌或寄主时都有产生虫草伪品。可见，仅针对真菌或者虫体进行鉴定来判断冬虫夏草真伪是不够的，不能真正反映冬虫夏草这个复合体的真实性。虽发明名称为“一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重PCR检测方法”、申请号为CN201710284515.2专利公开了一种使用虫和菌的二重引物来鉴别冬虫夏草的真伪，但是其虫的特异性引物扩增条带淡，扩增效果稳定性较差。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别冬虫夏草真伪的COI特异性引物对，能够更广范围内鉴别冬虫夏草的真伪；另外提供包含其的试剂盒、鉴别冬虫夏草真伪的PCR鉴别方法及其在鉴别鉴别冬虫夏草真伪中的用途。本发明鉴别别冬虫夏草真伪的方法，在广范围内鉴别冬虫夏草的真伪的同时，该方法扩增效果更明显、鉴别方法稳定可靠。

一方面，本发明提供一种鉴别冬虫夏草真伪的引物对，所述引物对为CC-2F/CC-2R，其序列如下：

CC-2F：5′-ATTAAGTCGTGGAAATG-3′；

CC-2R：5′-GATCAGGAATAGTGGGA-3′。