[发明专利]一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组、试剂盒以及方法

说明书

本发明提供了一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组、试剂盒以及方法，属于禽流感病毒亚型检测技术领域，所述方法检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组，包括N2‑F和N2‑R；H5‑F和H5‑R以及H9‑F和H9‑R；所述N2‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述N2‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述H5‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述H5‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述H9‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述H9‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。本发明提供的引物组和试剂盒操作简单、特异性好。

技术领域

本发明属于禽流感病毒亚型检测技术领域，尤其涉及一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组、试剂盒以及方法。

背景技术

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的一种急性传染病，被世界动物卫生组织列为A类疾病，我国将其列为一类动物疫病，禽流感给养禽业造成巨大经济损失。甲型流感病毒根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原的差异，将血凝素(HA)分为16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶(NA)分为9个亚型(N1-N9)。AIV的常用检测方法有血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)、琼脂扩散试验、逆转录-环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)、RT-PCR法等。HI、琼脂扩散试验等方便快捷，但敏感性较低，不适宜于微量病毒的检测；ELISA、荧光抗体法较为成熟，但不及RT-PCR方法敏感；常规RT-PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，需要特殊的基因扩增仪器。目前对于禽流感病毒不同亚型的检测尚没有一种灵敏度高且操作方便的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一种灵敏度高、特异性好的检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物、试剂盒以及方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组，包括N2-F和N2-R；H5-F和H5-R以及H9-F和H9-R；

所述N2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述N2-R的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；

所述H5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述H5-R的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示；

所述H9-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述H9-R的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。

优选的，所述引物组中的N2-F、N2-R、H5-F、H5-R、H9-F和H9-R引物的使用浓度独立为15～25μmol/μL。

本发明提供了一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的试剂盒，包括所述的引物组。

优选的，所述试剂盒还包括扩增缓冲液、重组酶聚合酶、ddH₂O和醋酸镁。

优选的，所述扩增缓冲液为RehydrationBuffer。

优选的，所述醋酸镁的浓度为250～300mmoL/L。

优选的，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。

本发明提供了一种非疾病诊断目的的检测禽流感病毒AIV不同亚型的方法，包括以下步骤：

1)按照TwistAmp DNAAmplification Kits试剂盒操作说明，将待测样品的DNA、引物组、Rehydration buffer和ddH₂O混匀后加入醋酸镁获得扩增体系；