[发明专利]抗ALS抑制剂类除草剂鼠尾看麦娘的检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及抗ALS抑制剂类除草剂鼠尾看麦娘的检测方法及试剂盒。本发明提供与鼠尾看麦娘ALS抑制剂类除草剂抗性相关的特异性DNA片段及用于检测抗ALS抑制剂类除草剂鼠尾看麦娘的特异性引物对，所述特异性DNA片段包括如SEQ ID NO.1所示的DNA片段在122位由丙氨酸突变为苏氨酸、或在197位由脯氨酸突变为苏氨酸，或在205位由丙氨酸突变为缬氨酸、或在376位由天冬氨酸突变为谷氨酸，或在574位由色氨酸突变为亮氨酸，或在653位由丝氨酸突变为天冬酰胺，或在654位由丝氨酸突变为酪氨酸。本发明的检测方法具有操作简便，速度快、成本低、准确度高等优势，适于推广应用。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及抗ALS抑制剂类除草剂鼠尾看麦娘的检测方法及试剂盒。

背景技术

乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase，简称ALS，EC 2.2.1.6)，是合成支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)的关键酶。ALS抑制剂类除草剂是以ALS酶为靶标的除草剂。该类除草剂喷施到杂草后，杂草ALS酶的活性被抑制，支链氨基酸合成受阻，最终导致植株死亡。由于具有高效、低毒、对环境污染小等优点，该类除草剂迅速成为全球应用最为广泛和最重要的除草剂之一。目前，全球已开发ALS抑制剂类除草剂56种，位于不同类型除草剂之首。在中国，广泛用于小麦田杂草防除的ALS抑制剂类除草剂主要有：苯磺隆，甲基二磺隆，啶磺草胺，双氟磺草胺等。

近几年来，河南、山东部分地区出现啶磺草胺等ALS抑制剂类除草剂对小麦田鼠尾看麦娘防治效果不明显、田间剂量已无法有效将其杀死的问题，并且发现有些鼠尾看麦娘种群对甲基二磺隆等ALS抑制剂类除草剂也产生了交互抗性。由于对抗药性杂草的认知不足，农民盲目加大药剂使用量，既增加用药成本，又加大药害风险，并且会导致更多抗性杂草的出现与发展，严重影响农药减量使用以及粮食增产、农民增收和国家粮食安全。因此，开发一种快速、简便易操作的抗药性杂草检测方法十分迫切。

传统的抗药性杂草检测方法通常需要到田间采集疑似抗性杂草的种子，催芽后播种在培养盆中，培养一定叶龄后喷施系列剂量的除草剂，继续培养一段时间，剪取地上部分称鲜重或烘干称干重后计算抑制中浓度和抗药性指数。此方法直观性强，能客观评价杂草抗性水平。但也有局限性，主要表现在：一是需建立植物培养室，并且培养杂草和检测周期长；二是不能从微观分子角度解释其抗性机制，不能用于指导科学用药以防止抗药性种群的发展。随着分子生物学技术在杂草抗药性机制方面的应用与发展，越来越多的抗药性杂草被发现，抗药性机制被明确。研究表明，植物体ALS 8个氨基酸(以拟南芥ALS为标准标注位点Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654)任何一个位点发生突变，均可导致对ALS抑制剂产生抗性。在欧洲，抗性鼠尾看麦娘ALS在197位由脯氨酸突变为苏氨酸已被发现，但其他位点氨基酸突变未见报道。因此，鼠尾看麦娘是否产生抗药性可以通过测定靶标ALS基因保守区的突变位点来确定。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供抗ALS抑制剂类除草剂鼠尾看麦娘的检测方法及试剂盒。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：本发明通过结合软件设计和大量的人工优化设计筛选，获得2对具有较高扩增效率和特异性的引物对，对不同农田采集的对ALS抑制剂具有不同抗性的鼠尾看麦娘进行PCR扩增和扩增产物的测序分析，通过对抗性鼠尾看麦娘和敏感鼠尾看麦娘的ALS基因序列进行比对分析，发现鼠尾看麦娘中导致ALS抑制剂类除草剂抗性的ALS突变位点。

本发明首先提供与鼠尾看麦娘ALS抑制剂类除草剂抗药性相关的特异性DNA片段，所述特异性DNA片段包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段编码氨基酸的122位由丙氨酸突变为苏氨酸、或在197位由脯氨酸突变为苏氨酸，或在205位由丙氨酸突变为缬氨酸、或在376位由天冬氨酸突变为谷氨酸，或在574位由色氨酸突变为亮氨酸，或在653位由丝氨酸突变为天冬酰胺，或在654位由丝氨酸突变为酪氨酸。