[发明专利]抗ALS抑制剂类除草剂鼠尾看麦娘的检测方法及试剂盒

权利要求书

1.与鼠尾看麦娘ALS抑制剂类除草剂抗药性相关的特异性DNA片段，其特征在于，所述特异性DNA片段包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段编码的氨基酸的第122位由丙氨酸突变为苏氨酸，或在197位由脯氨酸突变为苏氨酸，或在205位由丙氨酸突变为缬氨酸，或在376位由天冬氨酸突变为谷氨酸，或在574位由色氨酸突变为亮氨酸，或在653位由丝氨酸突变为天冬酰胺，或在654位由丝氨酸突变为酪氨酸。

2.用于检测抗ALS抑制剂类除草剂鼠尾看麦娘的特异性引物对，其特征在于，包括引物对1和/或引物对2；所述引物对1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示，所述引物对2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示。

3.包含权利要求2所述特异性引物对的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、标准阳性模板、Mg²⁺、DNA聚合酶中的一种或多种。

5.权利要求2所述特异性引物对或权利要求3或4所述试剂盒在检测抗ALS抑制剂类除草剂鼠尾看麦娘或指导农田除草用药中的应用。

6.一种抗ALS抑制剂类除草剂鼠尾看麦娘的检测方法，其特征在于，以待测鼠尾看麦娘样品的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的特异性引物对或权利要求3或4所述的试剂盒进行PCR扩增，分析扩增产物的序列。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94～98℃预变性2～5min，94～98℃变性10～30s，55～60℃退火10～30s，72℃延伸10～60s，循环25～40次，72℃延伸2～10min。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，当采用所述引物对1进行PCR扩增时，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸5min；

当采用所述引物对2进行PCR扩增时，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性4min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次，72℃延伸5min。

9.根据权利要求6～8任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的50μL反应体系如下：10×PCR反应缓冲液5μL，2.5mM dNTPs 2μL，引物混合液2μL，Taq DNA聚合酶1U，模板DNA2μL，双蒸水补至50μL；

所述引物混合液包括引物对1和/或引物对2；所述引物混合液中，各引物对的正向引物和反向引物的摩尔比为1：1。

10.根据权利要求6～9任一项所述的方法，其特征在于，所述分析扩增产物的序列为采用测序分析，所述抗ALS抑制剂类除草剂鼠尾看麦娘的判断标准如下：若所述待测鼠尾看麦娘样品的扩增片段的第122位由丙氨酸突变为苏氨酸，或在197位由脯氨酸突变为苏氨酸，或在205位由丙氨酸突变为缬氨酸，或在376位由天冬氨酸突变为谷氨酸，或在574位由色氨酸突变为亮氨酸，或在653位由丝氨酸突变为天冬酰胺，或在654位由丝氨酸突变为酪氨酸(以拟南芥ALS氨基酸序列为标准)，则所述待测鼠尾看麦娘为抗ALS抑制剂类除草剂鼠尾看麦娘。