[发明专利]用于鉴别变异型PEDV和TGEV的检测引物和探针

说明书

本发明属于动物传染病学检测领域，本发明提供一组用于鉴别变异型PEDV和TGEV的实时荧光定量PCR检测引物和探针。根据变异型猪流行性腹泻病毒N基因，设计一对检测引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO.1‑3所示；根据猪传染性胃肠炎病毒S基因，设计一对检测引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO.4‑6所示。根据所述引物和探针建立一种可以快速鉴别变异型PEDV和TGEV的实时荧光定量PCR方法。该方法与其他常见猪源病原体不发生非特异性的反应。本发明的方法可在短时间内快速鉴别诊断，省时省力省成本，同时具有特异性强，稳定性好，灵敏度高的特点，特别适合于临床上混合感染样品中的鉴别诊断。

技术领域

本发明提供一组用于鉴别变异型PEDV和TGEV的实时荧光定量PCR检测引物和探针，属于动物传染病学检测领域。

背景技术

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）是引起猪病毒性腹泻的主要病原。被感染的仔猪主要临床症状表现为腹泻、呕吐和脱水，各年龄阶段猪均可感染。由于两者引起的症状、病理变化和流行病学极为相似，且往往混合感染，单单凭借临床症状和组织病理学难以鉴别诊断。近年来其因其传染性强，死亡率高，给生猪养殖业造成不可估量的经济损失，严重困扰养猪业的发展。

PEDV为线性单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属。病毒粒子呈多形性，大小变化不一，其直径为95-190nm，囊膜上有花瓣状纤突，纤突短小而密集，纤突约长18-23nm，从核心向四周呈放射状分布，排列规则似皇冠。该病于1971年首先在英国发生，1978年比利时科学家从病料中分离到病毒，命名为CV777。我国于2010年发现新的变异型PEDV毒株，暴发了严重的疫情。TGEV为线性单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科，冠状病毒属。病毒粒子直径为90-200nm，呈椭圆形、圆形或多边形，有囊膜，表面有棒状纤突。该病于1933年首先发生于美国伊利诺伊州，1946年确定该病的病原体并做了详细的报告。我国于1958年发生本病。由于这2种病原体在临床上常表现为混合感染，同时变异型PEDV毒株与经典CV777毒株的遗传距离较远，因而给疫病的鉴别、诊断带来了很大困难，因此急需建立特异性的鉴别诊断方法。

当前，PEDV和TGEV两种病毒鉴别诊断的传统方法主要有病毒分离、免疫组织化学和电镜等常规的诊断技术，而传统方法由于操作繁琐、耗时长且成本较高，应用范围大大受到限制。随着分子生物学的发展，PCR检测方法，应用越来越广泛，TaqMan荧光探针法实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是在加入引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，从而出现荧光信号，通过收集荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此实时荧光定量PCR技术在检测病原时能够定性检测病原，而且还能通过荧光信号的收集实现定量的分析病毒含量的多少。多重荧光定量PCR是一种特殊的荧光定量PCR形式，其突出的特点是一次实时荧光定量PCR反应可同时检测多种病原，能实现对复杂病原或存在多种基因型的病原进行鉴别检测。

在临床上，猪病毒性腹泻疫病常呈混合感染状态，主要的病原有变异型PEDV和TGEV，两者感染的临床症状相似，很难从临床症状和病理变化上鉴别诊断。因此，建立能够同时对变异型PEDV和TGEV的鉴别检测方法，既可简化操作程序、节约成本，临床上可进行大样本的检测，对猪病毒性腹泻病毒的流行病学调查及开展相关的致病机理研究具有重要的意义，尤其是在混合感染的样品中的病原体鉴别检测上具有独特的优势和使用价值。

发明内容

本发明提供一组用于鉴别变异型PEDV和TGEV的实时荧光定量PCR检测引物和探针。建立能够同时对变异型PEDV和TGEV的鉴别检测方法，既可简化操作程序、节约成本，临床上可进行大样本的检测，对猪病毒性腹泻病毒的流行病学调查及开展相关的致病机理研究具有重要的意义，尤其是在混合感染的样品中的病原体鉴别检测上具有独特的优势和使用价值。