[发明专利]一种检测大肠杆菌活菌的方法

说明书

为解决现有技术中采用PMA‑qPCR方法检测活菌时的假阳性和假阴性问题，本发明提供了一种改进的检测和确定大肠杆菌活菌的方法，其在PMA‑qPCR方法的基础上，在PMA处理前增加了SDS处理步骤，在qPCR过程中增加了蜡样芽孢杆菌DNA作为扩增内参，很好的解决了原有方法的假阳性和假阴性的问题，提高了检测方法的灵敏性和特异性。

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及一种检测大肠杆菌活菌的方法。

背景技术

大肠杆菌是一种高风险致病菌，与我们的日常生活非常密切，其通常寄生在家畜粪便或是被粪便污染了的水中。当人们食用了被大肠杆菌污染的食物，就可能引发肠道外感染、急性腹泻等症状，同时伴有发热、呕吐等表现。在全世界范围内发现的大肠杆菌感染疾病的事件中，大多都是由食物传播而引起。

用于检测大肠杆菌的常规方法例如多管发酵法、滤膜法、平板计数法等方法廉价可靠，但费力费时。而基于PCR的方法由于其特异性和灵敏性，则可以克服常规方法的这些缺点。具体而言，实时荧光定量PCR(qPCR)可以实时或者快速检测牛奶样品中的大肠杆菌。然而，使用qPCR难以区分活细胞和死细胞，这导致了活细胞数量会被高估，特别是当死细胞数量超过活细胞数量的时候。

因此，采用qPCR法检测牛奶中大肠杆菌活菌时，会存在假阴性和假阳性的问题。PMA(叠氮溴化丙啶)-qPCR检测技术和EMA(叠氮溴化乙锭)-qPCR是近年来兴起的活菌检测技术，其原理是设计细胞膜不透性同时具有DNA高亲和力的光反应染料PMA或EMA等，穿透受损细胞的细胞膜，并使PMA或EMA嵌入双链DNA，暴露在强烈的可见光下形成共价键修饰的DNA，使其在PCR反应中的扩增被抑制，以达到区分死、活菌检测的目的。

但研究发现PMA-qPCR或EMA-qPCR检测结果仍存在高于实际活菌值的情况，这意味着存在部分非活菌的DNA在qPCR反应中完成了扩增的情况。PMA-qPCR或EMA-qPCR检测技术在检测经低温处理的活菌时不能有效区分活菌和死菌，易出现检测值偏高，检测结果不准确的情况。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种检测大肠杆菌活菌的方法，其采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法，可准确检测样品中大肠杆菌活细胞数量，灵敏度高。

本发明提供如下技术方案：

一种检测大肠杆菌活菌数量的方法，包括以下步骤：在提取菌体DNA之前，用细胞膜不透性的DNA亲和性的光反应染料处理菌体，光照反应后去除未反应的光反应染料，提取DNA进行实时荧光定量PCR(qPCR)，在进行qPCR时，加入蜡样芽孢杆菌的DNA作为扩增内参。

根据本发明，所述扩增内参的上游引物序列为：5’-CGCAAGGCTGAAACTCAAAG-3’(SEQ ID NO.1)、下游引物序列为：5’-GAGGATGTCAAGACCTGGTAAG-3’(SEQ ID NO.2)。

根据本发明，用于蜡样芽孢杆菌DNA片段的水解探针序列为：5’-ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA-3’(SEQ ID NO.3)。

根据本发明，进行qPCR时，扩增大肠杆菌的上游引物序列为：5’-GGTAGAGCACTGTTTTGGCA-3’(SEQ ID NO.4)、下游引物序列为：5’-TGTCTCCCGTGATAACTTTCTC-3’(SEQ ID NO.5)。

根据本发明，用于大肠杆菌DNA的水解探针序列为：5’-TCATCCCGACTTACCAACCCG-3’(SEQ ID NO.6)。

根据本发明，所述方法包括在用光反应染料处理菌体之前，向菌体中加入SDS的步骤。

作为本发明的一个实施方式，所述SDS加入后的终浓度为50-150ppm，例如为90-110ppm。在本发明的一个具体实施方式中SDS加入后的终浓度为100ppm。