[发明专利]一种检测大肠杆菌活菌的方法

权利要求书

1.一种检测大肠杆菌活菌数量的方法，包括以下步骤：在提取菌体DNA之前，用细胞膜不透性的DNA亲和性的光反应染料处理菌体，光照反应后去除未反应的光反应染料，提取DNA进行实时荧光定量PCR，其特征在于：在进行qPCR时，加入蜡样芽孢杆菌的DNA作为扩增内参。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌DNA的上游引物序列为：5’-CGCAAGGCTGAAACTCAAAG-3’、下游引物序列为：5’-GAGGATGTCAAGACCTGGTAAG-3’；

优选用于蜡样芽孢杆菌的水解探针序列为：5’-ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA-3’。

3.如权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，进行qPCR时，扩增大肠杆菌的上游引物序列为：5’-GGTAGAGCACTGTTTTGGCA-3’、下游引物序列为：5’-TGTCTCCCGTGATAACTTTCTC-3’；

优选用于大肠杆菌的水解探针序列为：5’-TCATCCCGACTTACCAACCCG-3’。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述光反应染料加入后的终浓度为30-50μM，更优选为35-45μM，其最优选为40μM；

优选所述光反应染料为PMA或EMA；优选为PMA。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括加入所述光反应染料处理菌体之前，向菌体加入SDS的步骤；

优选，所述SDS加入后的终浓度为50-150ppm，更优选为90-110ppm，更优选为100ppm。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述提取菌体DNA的步骤为用十六烷基三甲基溴化铵法提取DNA。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于检测乳或饮用水中大肠杆菌的活菌数量。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，还包括乳品前处理步骤，所述前处理步骤是富集乳中大肠杆菌；

优选所述乳品前处理步骤包括，离心乳品，去除上层脂肪及上清，洗涤沉淀后重悬沉淀。

9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括利用已知浓度的梯度稀释的大肠杆菌菌液制备细菌数量和qPCR Cq值的标准曲线的步骤；

优选所述标准曲线的制备步骤包括：取大肠杆菌活菌悬液，进行稀释后使菌液浓度为10⁷CFU/mL，然后提取DNA，将提取后的DNA按10倍梯度连续稀释5次，对每个浓度下的DNA分别进行qPCR反应，用CFX Manager 3.1计算得到标准曲线。

10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述去除未反应的光反应染料的步骤为将光照反应后的菌体混合物离心，并洗涤沉淀。