[发明专利]一种体外检测CYP11B1基因外显子拷贝数变异的方法

说明书

本发明涉及一种体外检测CYP11B1基因外显子拷贝数变异的方法，属于基因外显子拷贝数变异的方法技术领域。通过设计了一组特异性的MLPA探针，实现了CYP11B1基因全部9个外显子片段拷贝数变异的检测，大大简化了对CYP11B1基因外显子缺失或重复检测的实验操作。步骤1：探针在试剂盒中进行稀释；步骤2：采集受检者标本；步骤3：高温变性基因组DNA；步骤4：探针混合液联合或不联合参考探针混合液与变性后的基因组DNA进行杂交反应；步骤5：结合序列；步骤6：进行PCR扩增；步骤7：将PCR产物进行毛细管电泳；步骤8：分析、计算相对拷贝数变异信息。本发明首次实现了基于多重连接依赖探针扩增技术原理检测CYP11B1基因全部9个外显子拷贝数变异的特异性方法。

技术领域

本发明涉及一种体外检测CYP11B1基因外显子拷贝数变异的方法，属于基因外显子拷贝数变异的方法技术领域。

背景技术

CYP11B1基因的纯合突变或复合杂合突变可导致11β-羟化酶缺乏症的发生。11β-羟化酶在肾上腺中分别将11-去氧皮质醇和11-去氧皮质酮催化并转化为皮质醇和皮质酮。11β-羟化酶的缺乏导致皮质醇和皮质酮的合成减少，从而对促肾上腺皮质激素（ACTH）的负反馈抑制减少，使得垂体合成和分泌的ACTH增加，这样导致肾上腺皮质增生和类固醇前体的过量累积。

CYP11B1基因位于染色体8q21，由9个外显子组成。CYP11B1 基因突变导致其编码的11β-羟化酶活性降低或缺失，迄今为止已报道在有100多个CYP11B1基因突变影响11β-羟化酶功能，包括错义突变、无义突变、小缺失突变和剪接突变等，其中错义突变占据了大多数。目前针对CYP11B1基因的点突变或小缺失插入突变，主要使用采用常规PCR扩增CYP11B1基因的外显子及邻近侧翼区域序列，同时避免所用PCR引物与CYP11B2基因序列的互补配对结合，之后直接进行Sanger测序。1991年White PC等人首次设计了3个特异性PCR分别扩增了CYP11B1基因1~2号外显子、3~5号外显子和6~9号外显子相关区域，使用链末端终止法分析其扩增产物以检测出CYP11B1基因的点突变。2014年Menabo S等人也设计了3个特异性PCR分别扩增了CYP11B1基因1~2号外显子、3~5号外显子和6~9号外显子，其引物序列略做改变，其扩增产物直接用于测序。同时还发现了CYP11B1基因外显子缺失的现象，其中多数是由于CYP11B2/CYP11B1融合基因的形成进而导致了CYP11B1基因外显子的缺失；也存在CYP11B1基因外显子单纯性的缺失，如2012年Xu C等人报道了1例中国人在CYP11B1基因上449-bp纯合缺失，该缺失涉及了3号外显子部分序列和4号外显子全部序列。这些CYP11B1基因外显子的缺失，绝大多数是使用Southern blot方法及相关PCR测序方法所检出的。由于相关方法复杂，且通用性差， CYP11B1基因拷贝数变异的遗传学研究报道有限，缺乏CYP11B1基因拷贝数变异的系统研究。

在CYP11B1基因所在的染色体8q21约45kb相距的位置，存在着与其高度同源的CYP11B2基因。CYP11B1基因和CYP11B2基因，均包含9个外显子，具有95％的外显子序列同源性和90％的内含子序列同源性。CYP11B2基因高度同源序列的存在大大提高了实际检测CYP11B1基因序列改变的难度。仅2016年Menabo S等人应用多重连接依赖探针扩增技术设计了针对CYP11B1基因1号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子、9号外显子的探针，以研究1例11β-羟化酶缺乏症意大利西西里岛患者的突变情况。该研究所设计的6对探针并没有检测到CYP11B1基因的2号外显子、7号外显子、8号外显子；同时，因各族群或地区中存在不同的序列多态性分布及其特征，该研究所设计的6对探针可能也不适合检测东亚人（包括中国人在内）的CYP11B1基因。此外，在检索国内外相关专利后发现没有基于多重连接依赖探针扩增技术原理检测CYP11B1基因全部9个外显子片段拷贝数的有关专利。因此，目前还没有建立针对一般人群或东亚人群的CYP11B1基因全部9个外显子拷贝数变异的多重连接依赖探针扩增检测方法或体系。