[发明专利]羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法及其应用

说明书

本发明提供了羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法及其应用。羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法包括挖掘与检测羊踯躅提取物对不同癌细胞的抑制活性、羊踯躅提取物抑制癌细胞克隆形成的检测、羊踯躅提取物诱导细胞凋亡引起周期阻滞的分析、羊踯躅提取物对癌症凋亡及周期相关基因表达的分析等步骤。本发明为开发羊踯躅治疗癌症药物提供技术支持和科学依据。

技术领域

本发明涉及羊踯躅提取物，尤其涉及羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法以及羊踯躅提取物的应用方法。

背景技术

结肠直肠癌中常见的恶性肿瘤，其全球发病率(6.1％)位于癌症相关疾病中第四位，死亡率(9.2％)为第二位。而在我国，随着国民饮食结构的改变和生活水平的而变化，结直肠癌的发病率和死亡率逐年增加，2015新发病例37.6万，死亡病例19.1万，其中，城市地区远高于农村，且结肠癌的发病率上升显著。据统计，超过60～70％的结直肠癌者在疾病中晚期才被确诊，这使得患者的5年生存率仅为60％。目前对于结肠癌治疗的主要手段是通过手术治疗辅助放疗和化疗，这种方式的治疗不仅副作用较大，而且也给患者带来巨大的心理和经济上的压力。此外，尽管进行了手术及放疗和化疗，但仍然有高达30％的复发可能性。因此，我们需要更有效的治疗手段来降低结直肠癌的死亡率具有重要的意义。目前有许多中草药已经被证明有抗肿瘤活性，这为开发新的结肠癌治疗剂提供一个潜在的可能。

具有抗癌活性的天然产物一般可以通过对癌细胞的毒性、或诱导癌细胞凋亡、或引起癌细胞的周期阻滞、或导致癌细胞骨架的破坏等途径抑制癌细胞的增殖。例如白花蛇舌草粗提物能够通过上调细胞周期相关基因P21和P53的表达将癌细胞阻滞在S期，抑制癌细胞的增殖；红毛五加多糖能够通过上调癌细胞中的抑癌基因Bax的表达，下调Bcl-2来诱导癌细胞凋亡。天然草药的提取物已被用作治疗各种疾病，在治疗癌症中，由于副作用小和延缓癌症发展的优点，因此它们经常与抗癌药物联合用药治疗癌症。

羊踯躅(Rhododendron molle G.Don)又名黄杜鹃、闹羊花、八厘麻等，始载于《神农本草经》，是我国杜鹃花科羊踯躅亚属中仅有的一个原生种。它既是一种重要观赏植物，也是一种被列入《中国药典》(2015版)的药用植物，具有祛风除湿、散癖定痛之功效，用于治疗风湿痹痛、偏正头痛、跌打肿痛、顽癣等，民间有“跌倒地上爬，离不开八厘麻”的说法。目前关于羊踯躅的研究大多集中在植物化学、组织培养、遗传多样性以及其毒性的相关研究。很多研究表明，羊踯躅的根、花和果实含有大量的二萜、三萜、黄酮和木质素等化合物；同时也发现，羊踯躅具有广泛的药理学活性，包括止痛、抗炎、抗高血压和杀虫等。然而，目前有关羊踯躅抗癌活性及其作用机制的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法，并且提供一种羊踯躅提取物的应用方法。

为达到以上目的，本发明采用的技术方案包括以下步骤：

(1)制备出羊踯躅提取物：将新鲜采摘的羊踯躅的叶片洗涤干净，冷冻干燥后粉碎、过筛；用甲醇(1:10，W/V)室温浸泡过夜，回流提取三次，每次1.5小时；将提取液经过滤，再用旋转蒸发仪(设置温度为45～50℃，真空度为-0.08MPa)将提取液浓缩成膏状，膏状物质冷冻干燥后得到的干燥粉末即为羊踯躅提取物。技术指标为浸膏得率30％以上，浸膏冷冻干燥后的干燥粉末得率达10％以上。羊踯躅提取物可以用二甲亚砜(DMSO)溶解，在-20℃条件下保存。当然，也可以用其他方法制备羊踯躅提取物。得到羊踯躅提取物后，可以检测羊踯躅提取物的抗癌活性；