[发明专利]羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法及其应用

权利要求书

1.一种羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法，包括以下步骤：

(1)挖掘、检测羊踯躅提取物对不同癌细胞的抑制活性：将待检测的几种癌细胞接种于96孔板中，在37℃、5％CO₂的培养箱中孵育24小时，用不同浓度的羊踯躅提取物分别处理每种癌细胞，继续培养48～72小时后，用四唑盐比色法(MTT法)检测羊踯躅提取物对不同癌细胞细胞的增殖抑制作用；

(2)羊踯躅提取物抑制癌细胞克隆形成的检测：将对数生长的结肠癌HT-29细胞在37℃条件下继代培养24小时后，将培养液换成含不同浓度羊踯躅提取物的培养基共同培养，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养13天后，吸出培养基，用PBS冲洗，用4％多聚甲醛固定，结晶紫染色，用克隆形成数和克隆形成率来评价羊踯躅提取物对HT-29细胞克隆形成的影响；

(3)羊踯躅提取物诱导细胞凋亡引起周期阻滞的分析：将处于对数生长期的HT-29细胞继代培养24小时后，将培养基分别替换成含不同浓度羊踯躅提取物的完全培养基，对照组加入等量的含DMSO的完全培养基培养24小时；将细胞制成单个细胞悬液离心收集细胞，通过流式细胞仪检测细胞的凋亡与周期；

(4)羊踯躅提取物对癌症凋亡及周期相关基因表达的分析：将处于对数生长期的HT-29细胞接种于6孔板中，孵育过夜；然后用不同浓度的羊踯躅提取物处理细胞12小时，收集细胞用Trizol提取细胞总RNA；用反转录系统试剂盒反向转录RNA，运用实时荧光定量试剂盒对Bax、Bcl-2、P21和P53等基因表达水平进行定量分析；用β-actin基因的表达水平进行归一化，并用2^-ΔΔCT计算基因的表达水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(1)中，羊踯躅提取物的浓度分别为400、200、100、50、25μg/mL；四唑盐比色法的酶标仪检测波长为570nm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(2)中，含不同浓度羊踯躅提取物的培养基中，羊踯躅提取物的浓度分别为400、200、100、50、25、0μg/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(3)中，含不同浓度羊踯躅提取物的完全培养基中，羊踯躅提取物的浓度分别为400、200、100、50、25μg/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(4)中，羊踯躅提取物的浓度分别为400、200、100、0μg/mL。

6.一种羊踯躅提取物的应用，其特征在于：所述的羊踯躅提取物用于抑制结肠癌。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的羊踯躅提取物用于制备抑制结肠癌的药物。