[发明专利]一种用于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法

说明书

本发明发明了一种用于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法，所述引物探针包括两套上下游引物及探针，其序列分别如IS‑F1(SEQ ID NO：1)、IS‑F2(SEQ IDNO：3)、IS‑R1(SEQ ID NO：2)和IS‑R2(SEQ ID NO：4)；探针IS‑FAM1(SEQ ID NO：5)和IS‑FAM2(SEQ ID NO：6)；利用所述检测试剂荧光定量PCR扩增检测结核分枝杆菌复合群的方法，包括以下步骤：将待测基因样本与所述检测试剂混合，放置在荧光定量PCR仪中，采用touchdown循环程序，在退火阶段检测荧光值，根据有无荧光值，判断待检测基因样本是否属于结核分枝杆菌复合群。相对于现有技术，本发明通过检测结核分枝杆菌中的基因组，更加灵敏特异地检测结核分枝杆菌基因，有效区分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌。

技术领域

本发明涉及一种用于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法，属于结核 分枝杆菌检测试剂技术领域。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌等引起的慢性传染性疾病， 可累及全身各个器官，以肺结核最为多见。其中，结核病的病原菌主要是结核分枝杆菌，牛 结核分枝杆菌次之。结核分枝杆菌主要是经空气传播，大多数人在感染结核分枝杆菌后并无 症状，称为潜伏感染。潜伏感染可持续几十年，仅有5％-10％的潜伏感染者发展为活动性肺 结核。

在结核病的细菌学检验中，通常将分枝杆菌分为结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex)和非结核分枝杆菌(Nontuberculosismycobacteria，NTM)。结核 分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛结核分枝杆菌(M.bovis)、非洲分 枝杆菌(M.africanum)和田鼠分枝杆菌(M.microti)。在结核分枝杆菌复合群内各种中，除 田鼠分枝杆菌对人无致病力外，其他三种菌均可对人致病，产生大致相同的临床表现。因此， 临床上往往只做结核分枝杆菌复合群的鉴定而不进行亚种水平的鉴定，用于结核辅助诊断的 核酸检测试剂也常采用结核分枝杆菌复合群共有的核酸序列作为靶标来进行检测。

核酸检测是肺结核病原学诊断的重要参考。与其他实验室检查方法比较，核酸检测的价 值在于：(1)可快速鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌，提高涂片阳性肺结核的诊 断特异性；(2)与涂片比较，灵敏度较高，可提高涂片阴性肺结核的检出率；(3)与培养相 比，操作快速，可及早进行正确的医疗处置。

目前的分子生物学方法针对的靶基因多数为结核分枝杆菌的重复序列，IS6110由于其 在结核分枝杆菌复合群中的拷贝数为10-20，因此它从90年代以来一直作为结核分枝杆菌复 合群诊断的极好靶标，如在结核分枝杆菌AP018035.1菌株中有高达二十二个拷贝，在田鼠分 枝杆菌CP010333.1菌株中有八个拷贝，山羊分枝杆菌CP016401.1中有三个拷贝，在非洲分 枝杆菌CP014517.1、牛分枝杆菌CP015773.2株和牛分枝杆菌BCG株中有一个拷贝。有报道 称IS6110在一些地区的检测效果不佳(如东南亚地区和越南)，主要原因是因为部分菌株基 因组中仅含1个拷贝IS6110。鉴于此，我们同时选择只存在于结核分枝杆菌复合群中的IS1081 基因，该基因在结核分枝杆菌基因组中的拷贝数为5-7，在结核分枝杆菌基因检测中，同时 扩增这两基因，并且都使用同一荧光染料FAM进行标记，这样不但能提高检测的特异性，而

目前绝大部分定量PCR扩增都采用变性、复性和延伸三步的循环过程，而我们采用降落 PCR(touchdown PCR)，将退火温度的起始温度高于计算的Tm10度左右，在接下来的循环中， 退火温度每个循环降低1度，直到达到正常退火温度，一共进行10个循环，使用该方法增加 了PCR反应的特异性，降低非特异性产物的出现。

发明内容

发明目的：为了提高结核分枝杆菌复合群检测的灵敏性和特异性，本发明提供了一种用于荧 光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法。