[发明专利]一种H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒的检测方法

说明书

本发明提供一种同时检测和区分H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒的快速检测方法，分别比对了近年来分离到的H5亚型高致病性禽流感病毒和H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA基因核苷酸序列，在其保守区设计了引物和探针，建立了针对H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒实时荧光定量RT‑PCR核酸快速检测方法。本发明所提供的H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒实时荧光RT‑PCR方法具有灵敏度高、检测时间短，不需要电泳等开放环节，只需一台荧光PCR仪即可在一个密闭反应管中完成两种亚型禽流感病毒的检测，且在检测过程中可实时查看反应曲线，对结果作出快速判断。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测和区分H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒的快速检测方法。

背景技术

禽流感病毒根据对家禽致病性的不同，可以分为高致病性和低致病性禽流感病毒。其中，高致病性禽流感病毒包括H5和H7亚型的部分毒株。

1996年，我国首次从广东的鹅体内分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒。从2003年末开始，H5N1亚型高致病性禽流感在东南亚多个国家的家禽中暴发，包括越南、泰国、韩国、日本、柬埔寨和印度尼西亚。2004年至2015年，我国的多个省份暴发了疫情，超过2千万只禽类被扑杀，给养禽业造成了巨大的经济损失。2005年底开始，我国针对H5亚型高致病性禽流感病毒实行大规模强制免疫政策，疫情开始得到了有效控制。实践证明，在禽流感防控方面，疫苗免疫发挥了巨大的作用。

但是，在养殖过程中发现，疫苗免疫加快了病毒变异，使得疫苗必须加快更新换代。随着病毒的进化，H5亚型禽流感病毒一直在发生较快的变异；从最初的N28、Re-1到Re-4、Re-5，再到Re-6、Re-8，到最新的Re-11、Re-12。病毒变异是由于其血凝素基因(HA)中核苷酸的变异引起的。目前，全球H5亚型禽流感病毒共存在10个分支。我国存在或流行的分支包括第0分支、第2.3.4.4分支、第2.3.2.1分支和第7分支共4个分支，均为高致病性病毒。我国现在流行的毒株与1996年最初分离的病毒A/goose/Guangdong/1/1996(H5N1)的HA核苷酸同源性仅为90.6％(Re-11)和91.2％(Re-12)。以Re-11和Re-12疫苗株为代表的第2.3.4.4分支和第2.3.2.1分支HA核苷酸同源性仅为88.5％。HA核苷酸的快速变异增加了以核苷酸为靶基因的检测方法的难度，导致以HA基因为靶基因的检测方法的特异性、敏感性下降，造成假阴性的结果。

2013年我国从人群病例和家禽中检测到H7N9病毒，动物试验证明从家禽中分离到的H7N9病毒对家禽是无致病力或低致病力的。但随着H7N9病毒的演变，在经历了三年多时间之后，2016年底以来，H7N9禽流感病毒从弱毒株突变为强毒株，并在某些地区暴发了H7N9高致病性禽流感疫情。

H7N9病毒突变为高致病性毒株之后，对家禽业造成巨大的经济损失。其感染发病症状与H5亚型高致病性禽流感病毒极为相似，临床上难以区分。因此，检测和区分H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒对于疾病的诊断与防治具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种同时检测和区分H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒的快速检测方法，分别比对了近年来分离到的H5亚型高致病性禽流感病毒和H7N9亚型高致病性禽流感病毒HA基因核苷酸序列，在其保守区设计了引物和探针，建立了针对H5和H7N9亚型高致病性禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR核酸快速检测方法。

本发明首先提供一种用于检测H5亚型高致病性禽流感病毒的引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为ATGGAAAARAACGTYACTGT(SEQ ID NO：1)，

下游引物序列为AGCCATCCWGCYACACTRCAAT(SEQ ID NO：2)；

探针序列为AAGACATACTGGARAAGACACAYAAYGGGA(SEQ ID NO：3)，