[发明专利]检测样本中BAALC基因相对表达量的引物、探针及方法和试剂盒

说明书

本发明公开用于检测样本中BAALC基因的寡核苷酸、方法和试剂盒，其包括针对BAALC的上下游引物和探针，以及针对ABL内参基因的上下游引物和探针。本发明可快速检测样本中是否存在BAALC基因及其表达量的多少。利用本发明完成的检测结果准确且灵敏，可为人类急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)辅助制定个体化治疗方案和疾病预后判断。

技术领域

本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测样本中BAALC基因的方法、引物、探针和试剂盒，采用荧光PCR技术，检测人类急性髓系白血病(Acute MyeloidLeukemia，AML)患者体内BAALC基因的表达水平。

背景技术

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是最常见的白血病类型，主要由于白血病干细胞克隆性增殖，致骨髓正常造血功能受到抑制所致。AML诊断时存在的细胞遗传学异常是预测疾病预后的重要依据。近年来，采用分子遗传学来评价AML患者的预后，其中包括基因的异常表达和突变。BAALC(Brain And Acute Leukemia，Cytoplasmic)基因位于8q22.3，最早在神经外胚层组织中发现其表达。Tanner等于2001年在造血前体细胞中亦发现BAALC的表达。研究报道BAALC在AML患者中呈过表达，且其过表达是正常核型急性髓系白血病(AML with normal cytogenetics，CN-AML)患者预后不良的影响因素。国内亦有一些文献报道BAALC过表达的临床意义，然而其结果不尽相同。本研究应用实时定量PCR(real—time quantitative PCR，RQ-PCR)方法检测中国人群AML患者中BAALC的表达情况，并对其临床意义进行探讨。

BAALC基因定位于染色体8q22.3，编码一种与任何已知蛋白或功能域均无同源性的蛋白质。BAALC主要表达于神经外胚层来源组织和造血前体细胞，成熟的骨髓和外周血单核细胞不表达。AML、急性淋巴细胞自血病(acute lymphocytic leukemia。ALL)及CML急变期有BAALC基因的高表达，而CML慢性期及CLL则检测不到。自2001年Stephan等发现部分AML、ALL患者存在BAALC基因的过表达。且BAALC基因的过表达与AML患者的不良预后相关以来.研究BAALC基冈在AML中的表达水平及其与预后的关系成为近来的热点。定性RT—PCR，不利于观察基因表达水平。RQ—PCR具有可定量、敏感度高等优点，目前已经成为检测病毒和肿瘤基因表达的一个主要手段。

随着技术的进步，定量PCR技术已广泛应用于基因表达水平的研究。其中实时定量PCR是目前公认的最准确，重复性最好的定量PCR研究方法。其通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对起始模板定量及定性的分析，优点如下：l、特异性强，灵敏度高；2、封闭反应，无需PCR后处理；3、定量范围宽，可达到l0个数量级；4、采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确；5、仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断；6、可实现一管双检或多检；7、操作安全，缩短时间，提高效率。已成功用于肿瘤基因表达量的研究。常见的方法有SYBR GreenI染料法,双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于BAALC基因检测。

发明内容

本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因ABL和目的基因BAALC的定量标准曲线，检测目的基因BAALC相对于内参基因ABL的表达水平。通过调整目的基因和内参基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳，从而能够满足BAALC基因的检测，用于评价治疗效果、预测预后。

用于BAALC基因相对表达量的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：