[发明专利]用于选择性扩增核酸的寡核苷酸

说明书

本文提供用于核酸选择性扩增的方法和组合物。所述组合物包括具有序列特征的寡核苷酸，其允许在单一反应中从核酸的混合物同时并行扩增多个靶点。还提供使用此类寡核苷酸以识别个别靶点并且由核酸的混合物形成靶点库的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年10月20日提交的美国临时申请第62/575,051号的权益，所述申请以引用的方式并入。

技术领域

本发明大体上涉及用于对核酸进行选择性扩增和计数的方法和组合物。

背景技术

许多最常见疾病都存在基因基础。早期检测为治疗成功的关键因素。基因生物标记促进早期检测。技术和临床研究方面的进步已使得各种类型的RNA分子(包括mRNA和miRNA)作为疾病的生物标记而越来越有吸引力。此外，与蛋白质生物标记相比，RNA生物标记可以提供更好的灵敏度和特异性并且分析起来相对便宜。

用于分析RNA的现有方法具有若干缺点。举例来说，测序miRNA的方法涉及使用RNA连接酶将已知序列连接到RNA分子的末端，但连接反应的效率通常较差且取决于给定miRNA末端的序列而变化。mRNA可以通过全转录组鸟枪法测序(whole transcriptome shotgunsequencing)来测序，但所述方法产生来自所有转录物的序列信息，而不仅仅是诊断相关序列。因为给定疾病的靶点生物标记通常表示一小组mRNA群，所以要花费不成比例的分析时间量来舍弃不相关mRNA。mRNA群还可以通过与微阵列杂交来分析，但所述方法具有有限的灵敏度和吞吐量。另外，微阵列的形成是劳动密集型的，并且一旦制成就无法轻易地进行调适，因此其并不非常适合于诊断具有不同组的生物标记mRNA的多种疾病。另一方面，更灵敏且相对便宜的定量PCR(qPCR)具有同时分析多个mRNA生物标记的有限能力。因此，甚至一小组mRNA生物标记的分析也需要并行地进行多个qPCR反应，使得其对于大多数诊断来说并不可行。归因于现有RNA分析方法的技术、物流和财务障碍，本可以在早期检测到的基因疾病未被诊断，并且如心脏病、癌症和呼吸道疾病的病况每年继续使数百万人丧生和丧失能力。

发明内容

本发明提供用于从核酸分子(如miRNA或mRNA)的混合物扩增仅含有所关注序列的那些分子的组合物和方法。本发明的方法选择性地保护靶点诊断序列，同时允许非靶点序列降解。在一个方面，本发明的方法部分地依赖于将dC转化成dU并随后使含有的dU序列降解和/或使含有dU的序列不能充当DNA聚合酶的模板。举例来说，含有所关注的RNA的样品暴露于包含与靶点RNA互补的序列和用作模板依赖性碱基延伸的引发位点的部分的构建体。此杂交混合物接着用亚硫酸氢盐处理，所述亚硫酸氢盐将未配对胞嘧啶碱基转化成尿嘧啶。接着，通过例如使用通用引物的PCR扩增不含尿嘧啶的寡核苷酸以由配对寡核苷酸产生DNA分子集合。因此，扩增DNA分子的集合仅包括含有在寡核苷酸的汇集中展现并且存在于起始RNA分子群中的序列的DNA分子。通过对扩增DNA分子集合中的物种计数，可以确定起始群中所关注的不同RNA物种的数目和相对丰度。本发明还提供用于进行此类方法的寡核苷酸。

在另一实例中，使用具有与靶点RNA序列杂交的中心区的模板。中心区在任一端上藉由3'和5'区定界。3'区可为任何适当长度，但优选地包含至少约10个碱基。3'区可以含有所有四个沃森-克里克碱基(Watson-Crick base)的混合物或可缺乏胞嘧啶。5'区通常长于3'区但应为至少约10个碱基(因此可与3'区长度相同)。在其中使用多个模板的优选实施例中，所有3'区共有共同序列。5'区还可由所有四个沃森-克里克碱基构成，但必须含有胞嘧啶。靶点RNA粘合于模板的中心区，DNA聚合酶用于使用5'区作为模板进行模板依赖性碱基延伸。在延伸之后，用亚硫酸氢钠或等效处理(如胞嘧啶脱氨酶)处理样品以将dC残基转化成dU。将所暴露的dC残基转化成dU，但保护呈双链(即，归因于碱基延伸)的那些残基。未经粘合和延伸的RNA经酶降解或不能够在后续PCR中扩增。仅将保留且随后分析经保护的模板。