[发明专利]用于遗传不稳定性的数字扩增试验

说明书

使用数字扩增试验检测遗传不稳定性的方法和组合物。该方法可以在一组分离的样份中进行，并且通常可涉及竞争物和探针/引物与微卫星基因座的正常等位基因和一个或多个突变等位基因的竞争性杂交。可以设置竞争物，使其在与正常等位基因杂交方面与引物/探针相似地竞争或在竞争中胜过引物/探针。可以设置引物/探针，使其在与基因座的各种突变等位基因杂交方面胜过竞争物，所述各种突变等位基因对重复序列的长度造成不同量的改变。可以对其中引物/探针在竞争中胜过竞争物的分离的样份进行计数，其代表一种或多种突变等位基因。该方法可以能够诊断微卫星不稳定性并基于该诊断对对象进行治疗。

在先申请的交叉引用

本申请基于2017年6月20日提交的美国临时专利申请序列号62/522,619并根据35U.S.C.§119(e)要求其权益，该申请通过引用全部纳入本文用于所有目的。

导言

可以使用扩增试验测试生物学样品中靶序列的存在，所述扩增试验可以在批量相(例如，实时试验)或一组分离的样份(例如，数字试验)中进行为了进行数字扩增测试，可以将样品分配到分离的样份(volume)中，每份包含试剂以支持靶序列的扩增以形成扩增子，如通过聚合酶链反应(PCR)。分离的样份中仅一子集接收至少一个拷贝的靶序列。样份可经历促进靶序列扩增到终点的条件，诸如热循环。达到终点后，可以从样份检测信号。信号可以指示所述样份中的哪些包含扩增子因而在样份形成时接收到至少一个拷贝的靶序列。可以通过泊松统计使用对扩增子呈阳性(或阴性)的样份的数量以及样份的总数来计算靶序列的浓度。

针对含有微卫星重复序列的靶序列的扩增试验可能是有问题的这些试验可能受困于无效靶序列扩增、低信号和/或高背景。此外，包含整个重复序列的靶序列的正常等位基因可能无法与缺少来自重复序列的核苷酸的靶序列的突变等位基因区分。需要新的扩增试验来检测改变重复序列的突变等位基因。

发明内容

本公开提供了使用数字扩增试验用于检测遗传不稳定性的方法和组合物。该方法可以在一组分离的样份(volume)中进行，并且通常可涉及竞争物(competitor)和探针/引物与使用微卫星基因座的正常等位基因和一个或多个突变等位基因的竞争性杂交。可以设置竞争物，使其在与正常等位基因杂交方面与引物/探针相似地竞争或在竞争中胜过引物/探针。可以设置引物/探针，使其在与基因座的各种突变等位基因杂交方面胜过竞争物，所述各种突变等位基因对重复序列的长度造成不同量的改变。可以对其中引物/探针在竞争中胜过竞争物的分离的样份进行计数，并且代表一种或多种突变等位基因。该方法可以能够诊断微卫星不稳定性并基于该诊断对对象进行治疗。

附图说明

图1是本文所公开的各种试验设置中可能发生的竞争的示意图，即竞争物和试剂(引物/探针)与微卫星基因座的正常等位基因和突变等位基因的竞争性杂交。

图2是使用与正常等位基因内的重叠序列退火的探针对来检测突变等位基因的示例性试验设置的示意图，所述突变等位基因改变基因座的正常等位基因中存在的重复序列。

图3是由图2的试验设置所产生的样份的示意图，其中所述样份包含基因座正常等位基因的两个拷贝，并且探针对在扩增期间以相似的亲和力与正常等位基因的相应拷贝退火，从而使用两个探针将样份检测为扩增阳性。

图4和5是由图2的试验设置所产生的不同样份的示意图，其中各样份包含具有缺失(图4)或插入(图5)的基因座的突变等位基因的两个拷贝，并且因为所述缺失或插入，在与突变等位基因退火方面，两个探针中的一个在竞争中胜过另一个探针，从而仅使用这两个探针中的一个将样份检测为扩增阳性。

图6是与图2的设置相关的示例性试验设置的示意图，不同之处在于用未标记的竞争物代替探针之一，所述未标记的竞争物在与正常等位基因杂交方面胜过剩余的探针，从而仅检测突变等位基因。