[发明专利]用于遗传不稳定性的数字扩增试验

权利要求书

1.一种检测使微卫星基因座正常等位基因中存在的重复序列改变的突变等位基因的方法，所述方法包括：

形成一组分离的样份，每份包含(i)引物对，其包含设置成扩增正常等位基因和各突变等位基因的正向引物和反向引物，(ii)具有标记物的第一探针，和(iii)具有标记物的第二探针，其中，所述样份中仅一子集的每份包含所述正常等位基因，并且其中，多个样份的每份不包含所述突变等位基因；

使用所述引物对产生扩增子；和

由各探针的标记物收集扩增数据；

其中所述第一探针的链和第二探针的链以相似的效率与对应于所述正常等位基因的扩增子竞争性杂交，其中所述第二探针的链设置成在与对应于所述各突变等位基因的扩增子杂交方面胜过所述第一探针的链，并且其中相对于所述第二探针的链，所述第一探针的链在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列的较多核苷酸碱基配对。

2.如权利要求1所述的方法，其中，由所述第二探针的标记物而非所述第一探针的标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表一个或多个突变等位基因。

3.如权利要求2所述的方法，其中，由所述第一探针的标记物和所述第二探针的标记物在数据中指示为扩增阳性的分离的样份代表所述基因座的正常等位基因。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述突变等位基因包括多个缺失等位基因，其各自与所述正常等位基因重复序列相比缺少不同数量的核苷酸。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一探针的链在与所述正常等位基因杂交时与所述重复序列形成至少8个连续碱基对。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述重复序列包含至少8个核苷酸的单核苷酸序列。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述收集扩增数据的步骤包括由各探针的标记物检测光致发光，还包括基于将检测到的光致发光强度与一个或多个阈值进行比较的步骤，就各探针将单独份物质指定为扩增阳性或扩增阴性。

8.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一和第二探针中的至少一个为包含彼此杂交的一对链的双链探针。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述微卫星基因座选自下组：BAT25、BAT26、NR21、NR24和MONO27。

10.如权利要求1所述的方法，其还包括使用所述扩增数据确定所述微卫星基因座是否不稳定的步骤。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述确定步骤包括使用所述扩增数据获得突变等位基因水平的步骤和比较所述突变等位基因和预定阈值的步骤。

12.如权利要求11所述的方法，其中，所述方法对于多个不同的微卫星基因座中的每一个均使用同一样品进行，其还包括基于就所述样品而言确定为不稳定的基因座的数量来确定对于所述样品的微卫星不稳定性的存在或程度的步骤。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述样品分离自对象，任选地，所述样品是癌症相关样品，如肿瘤样品，所述方法还包括基于确定微卫星不稳定性的存在或程度的步骤向所述对象给予至少一种免疫治疗剂的步骤。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述至少一种免疫治疗剂包括检查点抑制剂。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述检查点抑制剂是派姆单抗。

16.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一探针是分子信标探针。

17.如权利要求1所述的方法，其中，所述正常等位基因在所述分离的样份中随机分布。